circ_0084927靶向miR-623調控喉癌TU177細胞增殖和凋亡的機制研究

王永軍，周梅花，錢小飛，陳建良，王達飛

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一[1]。據報道，2018年全球喉癌新發病例177 422例，死亡94 771例[2]。早期喉癌患者經手術、放療和(或)化療后生存情況較好，但晚期患者預后仍較差[3-5]。因此，了解喉癌發生、進展的驅動因素，對研究新的有效治療方法至關重要。環狀RNA(circRNA)具有吸附微小RNA(miRNA)、調控轉錄和剪接、翻譯蛋白、調節RNA-結合蛋白等生物學功能[6]。circRNA表達失調參與喉癌細胞增殖、轉移等惡性過程，在喉癌發生過程中發揮重要作用[7-8]。有研究報道，宮頸癌中circ_0084927表達水平上調，沉默circ_0084927可抑制宮頸癌細胞增殖和黏附，促進細胞凋亡，導致細胞周期阻滯[9]。然而，circ_0084927在喉癌中的表達及生物學功能尚不清楚。生物信息學分析顯示，miR-623是circ_0084927的潛在靶點。研究證實miR-623在胰腺癌、乳腺癌等多種實體惡性腫瘤中異常低表達，其過表達可抑制癌細胞體內外遷移及體外轉移過程[10-11]。敲減circ_0000144通過上調miR-623表達可抑制胃癌細胞增殖、侵襲、谷氨酰胺代謝，加速細胞凋亡[12]。本研究探討circ_0084927靶向miR-623在喉癌進展中的作用，旨在揭示喉癌進展的可能機制，并為治療提供可用靶點。

1 材料與方法

1.1組織來源 收集2017年6月—2019年6月在我院接受手術治療的喉癌41例，取癌組織及對應癌旁組織(正常黏膜組織)，男38例，女3例，年齡51～72歲，中位年齡63歲；術前均未接受放化療或其他生物療法。所有患者或其家屬簽署知情同意書，本研究獲得我院醫學倫理委員會批準。

1.2細胞和試劑 人喉癌細胞TU177(上海弘順生物科技有限公司)；重組熒光素酶報告質粒、si-NC、si-circ_0084927、miR-NC、miR-623、pcDNA、pcDNA-circ_0084927、anti-miR-NC、anti-miR-623購自廣州銳博生物公司；Omniscript逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒、miScript逆轉錄試劑盒(德國Qiagen公司)；細胞計數試劑盒(CCK-8)、Trizol試劑、BCA蛋白分析試劑盒(武漢博士德生物公司)；膜聯蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測試劑盒(上海銳賽生物公司)；剪切型半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase3)兔多克隆抗體(ab2302)、甘油酸-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔多克隆抗體(ab9485)、羊抗兔IgG二抗(ab205718)、Cleaved-caspase3兔多克隆抗體(ab2324)購自上海艾博抗貿易公司。

1.3方法

1.3.1RT-qPCR檢測circ_0084927和miR-623表達：用Trizol試劑從喉癌組織中提取總RNA，為檢測circ_0084927表達，使用Omniscript逆轉錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉錄成cDNA；為檢測miR-623表達，使用miScript逆轉錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉錄成cDNA。利用SYBR Green PCR試劑盒對cDNA進行RT-qPCR。U6、GAPDH分別為miR-623、circ_0084927的內參，2-ΔΔCt法計算circ_0084927和miR-623相對表達水平。circ_0084927上游引物5′-CTGGTGCAGCAAGATGGAAC-3′，下游引物5′-CTGCACCTCCCTTGGCAATA-3′；GAPDH上游引物5′-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3′，下游引物5′-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT-3′；miR-623上游引物5′-GCCGAGTGGGTTGTCGGGGACG-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.3.2細胞培養和實驗分組：TU177細胞接種于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養基，在37 ℃、濕度飽和、含5% CO2的培養箱孵育。1∶2～1∶3傳代。每周換液2～3次。將對數期TU177細胞接種于24孔板，密度為2×104個/孔，細胞50%融合時將si-NC、si-circ_0084927、miR-NC、miR-623 mimics、pcDNA、pcDNA-circ_0084927、si-circ_0084927+anti-miR-NC、si-circ_0084927+anti-miR-623分別轉染TU177細胞，分為si-NC組、si-circ_0084927組、miR-NC組、miR-623組、pcDNA組、pcDNA-circ_0084927組、si-circ_0084927+anti-miR-NC組、si-circ_0084927+anti-miR-623組。轉染48 h后，收集細胞應用RT-qPCR檢測circ_0084927和(或)miR-623表達水平，隨后進行以下實驗。

1.3.3CCK-8法檢測細胞活力：將各組TU177細胞接種于96孔板，密度為5×103個/孔，細胞貼壁后每孔加入10 μl CCK-8溶液培養箱孵育2 h，用酶標儀在450 nm處測定光密度(OD)值以表示細胞活力。實驗重復3次。

1.3.4流式細胞術檢測細胞凋亡情況:用含有5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶的100 μl 1×結合緩沖液重懸各組TU177細胞，細胞密度為1×106/ml。避光孵育15 min后，加入400 μl 1×結合緩沖液，混勻，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。取3次實驗數據進行分析。

1.3.5平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力:將各組TU177細胞接種于6孔板，密度為2×103個/孔，置于培養箱孵育2周直到出現細胞克隆，期間每3天換液1次，4%多聚甲醛固定細胞克隆15 min，0.1%結晶紫染色20 min，在顯微鏡下計數>50個細胞的克隆數，收集3次重復數據。

1.3.6Western blot檢測Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達:用BCA蛋白分析試劑盒對提取的蛋白進行定量，隨后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。利用半干轉膜儀將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h，隨后分別用一抗室溫孵育膜1 h，包括Cleaved-caspase3抗體、Cleaved-caspase9抗體、GAPDH抗體；然后用酶標二抗室溫孵育膜2 h。應用增強化學發光試劑盒對蛋白條帶進行顯色。實驗重復3次。以Image J軟件測得的目的蛋白和內參GAPDH灰度值的比值表示蛋白表達水平。

1.3.7雙熒光素酶報告實驗：根據Circular RNA Interactome預測結果擴增circ_0084927野生型(WT)和突變型(MUT)序列，并將其插入PGL4載體中，構建重組質粒WT-circ_0084927、MUT-circ_0084927。將miR-623 mimics、miR-NC分別與WT-circ_0084927或MUT-circ_0084927共轉染TU177細胞，孵育48 h后用雙熒光素酶檢測系統檢測熒光素酶活性。實驗重復3次。將螢火蟲熒光素酶活性歸一化為海腎熒光素酶活性表示相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1circ_0084927和miR-623在喉癌組織中的表達 與癌旁組織比較，喉癌組織中circ_0084927相對表達水平升高，miR-623相對表達水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 喉癌組織和癌旁組織circ_0084927和miR-623的表達水平比較

2.2干擾circ_0084927表達對喉癌TU177細胞增殖、凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響 與si-NC組比較，si-circ_0084927組TU177細胞circ_0084927相對表達水平、OD值、克隆形成數降低,凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達水平升高(P<0.01)。見圖1和表2。

圖1 干擾circ_0084927表達對喉癌TU177細胞凋亡相關蛋白表達的影響

表2 干擾circ_0084927表達對喉癌TU177細胞增殖、凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響

2.3miR-623過表達對喉癌TU177細胞增殖、凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響 與miR-NC組比較，miR-623組TU177細胞miR-623相對表達水平、凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達水平升高，OD值及細胞克隆形成數降低(P<0.01)。見圖2和表3。

圖2 miR-623過表達對喉癌TU177細胞凋亡相關蛋白表達的影響

表3 miR-623過表達對喉癌TU177細胞增殖、凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響

2.4circ_0084927靶向調控miR-623的表達 Circular RNA Interactome預測到circ_0084927與miR-623序列間存在互補結合位點，見圖3。miR-NC和WT-circ_0084927共轉染后TU177細胞相對熒光素酶活性為1.01±0.06，miR-623 mimics和WT-circ_0084927共轉染后為0.48±0.05；與miR-NC和WT-circ_0084927共轉染比較，miR-623 mimics和WT-circ_0084927共轉染后TU177細胞相對熒光素酶活性降低(P<0.01)。miR-NC和MUT-circ_0084927共轉染后TU177細胞熒光素酶活性為1.02±0.08，miR-623 mimics和MUT-circ_0084927共轉染后為0.99±0.06；miR-623 mimics和MUT-circ_0084927共轉染后TU177細胞相對熒光素酶活性與miR-NC和MUT-circ_0084927共轉染比較差異無統計學意義(P>0.05)。pcDNA、pcDNA-circ_0084927、si-NC、si-circ_0084927組TU177細胞miR-623表達水平為1.00±0.00、0.35±0.04、0.98±0.06、3.07±0.24；pcDNA-circ_0084927組TU177細胞miR-623表達水平低于pcDNA組，si-circ_0084927組TU177細胞miR-623表達水平高于si-NC組(P<0.05)。

圖3 circ_0084927與miR-623序列中互補的結合位點

2.5抑制miR-623表達逆轉了干擾circ_0084927表達對喉癌TU177細胞增殖和凋亡的作用 與si-circ_0084927+anti-miR-NC組比較，si-circ_0084927+anti-miR-623組TU177細胞miR-623相對表達水平、凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達降低，細胞OD值、克隆形成數升高(P<0.01)。見圖4和表4。

3 討論

circRNA在喉癌進展中作用已被證實。有研究發現，circ_0067934高表達與喉癌患者臨床病理特征顯著相關，circ_0067934高表達提示預后較差[13]。circRNA Ras相關序列家族2通過與miR-302b-3p相互作用并上調胰島素樣生長因子-1受體表達來促進喉癌的進展[14]。沉默circ_0042823對喉癌細胞增殖、轉移及體內腫瘤生長均有抑制作用[15]。

圖4 抑制miR-623表達逆轉了干擾circ_0084927表達對喉癌TU177細胞凋亡的作用

表4 抑制miR-623表達逆轉了干擾circ_0084927表達對喉癌TU177細胞增殖和凋亡的作用

circ_0084927是一種高表達的circRNA，研究證實敲低circ_0084927基因可明顯抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞周期阻滯[16]；敲除circ_0084927通過上調miR-142-3p表達還可促進乳腺癌細胞凋亡，抑制細胞增殖和侵襲[17]。本研究結果顯示，circ_0084927在喉癌組織中表達水平顯著上調，推測circ_0084927上調可能促進了喉癌的進展。功能分析顯示，轉染si-circ_0084927干擾circ_0084927表達可降低TU177細胞OD值和克隆能力，促進細胞凋亡；干擾circ_0084927表達后促凋亡因子Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9表達水平亦顯著升高。提示干擾circ_0084927表達可能通過激活caspase途徑誘導細胞凋亡。上述研究結果表明，circ_0084927在喉癌中具有癌基因樣作用，干擾circ_0084927表達通過調控細胞增殖和凋亡能夠抑制喉癌進展。

circ_0084927在腫瘤進展中的作用均與調控miRNA有關。研究指出，circ_0084927通過靶向下調miR-142-3p、miR-634誘導靶mRNA表達上調促進宮頸癌惡性進展[18]。本研究結果證實，過表達circ_0084927可抑制miR-623表達，而干擾circ_0084927表達則促進miR-623表達，且circ_0084927與miR-623存在直接相互作用，提示circ_0084927可靶向負性調控miR-623表達。有研究報道，miR-623靶向X線交叉互補修復基因5可降低肝癌細胞增殖、侵襲能力，并促進細胞凋亡[19]。miR-623靶向細胞周期蛋白D1基因可抑制胃癌細胞增殖并增強其對5-氟尿嘧啶的化學敏感性[20]。此外，miR-623還可介導敲低長鏈非編碼RNA羧基末端結合蛋白1反義RNA2對肝癌進展的抑制作用[21]。本研究發現，喉癌組織中miR-623表達降低，過表達miR-623可誘導TU177細胞凋亡，抑制細胞增殖，促進Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達，與干擾circ_0084927在喉癌中的抗腫瘤作用類似。為證實干擾circ_0084927表達的抗腫瘤作用依賴于miR-623表達水平升高，本研究將si-circ_0084927、anti-miR-623共轉染TU177細胞，結果顯示抑制miR-623表達可顯著減弱干擾circ_0084927對TU177細胞增殖和凋亡的影響，表明circ_0084927至少通過靶向下調miR-623參與喉癌進展。

綜上所述，circ_0084927在喉癌中表達上調，干擾circ_0084927通過靶向上調miR-623表達可抑制喉癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。circ_0084927的作用機制與靶向負性調控miR-623表達有關。因此，靶向抑制circ_0084927/miR-623途徑可能是一種有效的喉癌治療策略。