基于c-Met抗體的近紅外熒光探針用于肝癌的活體成像研究

易柳彤 楊美林 宮娜娜 余美紅 曹婉維 李展宇 李丹

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，盡管肝癌的診療水平在不斷地提高，但肝癌的新發病例和死亡病例仍居高不下[1-2]。目前肝切除術是肝癌根治的最主要手段[3]，然而作為一種高侵襲性腫瘤，肝癌往往呈浸潤性生長，其衛星灶及浸潤邊界往往難以識別，且肝臟毗鄰腹腔大血管、膽道、胃等重要器官，常規手術后并發癥高達15%～50%，5年復發率達70%[1,3-4]。因此，術中肝癌的檢出率和邊界精準識別能力的提高，將有利于延長肝癌患者的生存時間，提高患者的生存質量。

基于熒光成像的手術導航有助于肝癌的精準診療。近年來，美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）是一種非靶向近紅外熒光探針，其在正常肝細胞和癌變肝細胞間的代謝差異，導致ICG在癌變肝細胞中的異常累積，從而實現肝癌病灶的熒光成像，在肝癌的精準切除中具有重要的臨床意義[5-6]。但有研究表明，瘤周正常肝組織對ICG的排泄功能受累，形成的背景信號干擾了腫瘤邊界的精確界定[7]。而特異性靶向的探針，主要是聚集于病灶處，能正確顯示腫瘤的手術切緣，從而減少正常組織過度切除[8]。目前靶向表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的探針能夠特異靶向聚集于腫瘤組織，并且受背景熒光信號干擾少，可提高腫瘤組織的成像對比度，在頭頸鱗癌、胰腺癌和食管癌等腫瘤中有一定的臨床應用價值[9-10]。因此，靶向熒光探針更加有利于微小腫瘤及腫瘤邊界的術中精準可視化，實現肝癌的完整切除。

肝細胞生長因子受體（cellular mesenchymalepithelial transition factor，c-Met） 是 一 種 酪 氨 酸激酶型受體，與配體肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）結合后被激活，參與惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉移[11]。經調研發現，c-Met在胃癌、食管癌和結直腸癌等惡性消化道腫瘤中異常高表達，其中在肝癌中高表達，約65%[12-13]，并且與肝癌的增殖和肝內轉移相關，已經成為肝癌診療的重要靶點[14-15]?；诖?，靶向c-Met的近紅外熒光探針在肝癌的精準診療中將會有重要的應用價值。

本研究采用一種靶向c-Met并已經進入臨床Ⅰ期試驗抗體偶聯藥物中的單抗SHRmAb[16]和一種具有散射小、背景熒光信號低和組織穿透能力強等優點的近紅外熒光染料IRDye800CW[10]，成功合成并表征了靶向c-Met探針SHRmAb-IR800[17-18]，通過流式細胞術和共聚焦成像驗證了該探針能與肝癌細胞特異性結合，并通過動物模型的體內成像檢測了該探針能靶向聚集于c-Met陽性的腫瘤組織，基于此來探索該探針的肝癌檢測能力和評估其潛在的應用價值。

資料與方法

一、獲取c-Met的表達信息

從TCGA數據庫中獲取c-Met mRNA（MET）在人腫瘤組織中的表達信息，并比較人肝癌組織和正常肝組織中的MET表達（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）。然后從HPA數據庫中提取人腫瘤組織中c-Met蛋白的表達信息（http://www.proteinatlas.org）。

二、細胞系及細胞培養

人卵巢癌細胞株（A2780）和人肝癌細胞株（SK-Hep1和Hep 3B）來自美國模式培養物研究所，而人肝癌細胞SMMC7721來源于中國上?？茖W院細胞庫。將基礎培養基RPIM-1640配制成含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉菌素的完全培養基，并用完全培養基RPIM-1640培養A2780、SKHep1、Hep 3B和SMMC7721細胞。所有細胞均置于含5% CO2的37℃培養箱中培養。

三、Western Blot分析

用RIPA裂解液（P0013C，上海碧云天公司）充分裂解細胞后離心獲得總蛋白，然后用BCA法測定蛋白的濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉至PVDF膜上，再分別用抗c-Met抗體（8198，美國CST公司）和抗內參蛋白GADPH抗體（2118，美國CST公司）于4℃冰箱中孵育過夜，然后用TBST溶液清洗膜3 次后，再加入對應的辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG抗體（7074，美國CST公司）室溫孵育1 h，接著用TBST溶液清洗膜3次后，將膜置于ChemiDocXRS +成像儀（美國Bio-Rad 公司）中進行顯像。最后重復試驗3次后，用Image J 軟件進行灰度分析。

四、流式細胞術分析

將腫瘤細胞培養于10 cm培養皿中，待其生長約90%時，用Accutase消化酶（A6964，美國Sigma公司）將細胞消化至離心管中，然后用PBS清洗離心3次，接著用10 μg/mL抗體（SHRmAb/IgG2或SHRmAb-IR800/IgG2-IR800）于冰面孵育細胞30 min，再用PBS清洗，然后加入Alexa Fluor 488山羊抗人IgG 抗體（縮寫Alexa 488，1∶200）于室溫孵育細胞30 min。最后用PBS清洗和1 000 rpm離心4 min，棄上清，重復3次后，用250 μL PBS重懸細胞并于流式細胞儀下檢測。

五、共聚焦熒光成像實驗

將3～5 ×104腫瘤細胞接種于共聚焦皿中，培養48 h后用于共聚焦熒光成像。棄培養基后加入PBS清洗，然后再加入10 μg/mL抗體（SHRmAb/IgG2或SHRmAb-IR800/IgG2-IR800）于冰面孵育細胞30 min。接著再加入4%多聚甲醛固定20 min和0.2% Triton通透5 min。最后加入Alexa 488二抗室溫孵育30 min，棄二抗，再用PBS清洗3次，加入抗熒光淬滅劑（含DAPI） （S2110-5，北京索萊寶公司）染核5 min后，于共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）下成像。

六、肝癌動物模型的構建

本研究的相關動物實驗已經通過我院動物倫理委員會的批準（00043）。從廣東省動物中心購買4～6周齡的雌性BALB/c-nu裸鼠，用于肝癌皮下瘤模型的構建。主要是用胰島素注射器將100 μL含3 ×106個SK-hep1細胞的混懸液注入小鼠的右肩，共構建6只皮下瘤小鼠模型，建模一周后，隔天用游標卡尺監測腫瘤的大小，待腫瘤生長到200 mm3則可進行成像實驗。

七、探針在動物模型中的近紅外熒光成像

用異氟烷氣體麻醉裸鼠之后，再給其尾靜脈注 射45 μg抗 體 探 針（SHRmAb-IR800或IgG2-IR800），然 后 于 注 射 后 0.5、6、24、72和 96 h用小動物活體光學成像系統（美國PerkinElmer公司）進行探針的成像（激發光：760 nm；發射光：845 nm）。在96 h時將小鼠安樂死，并取出小鼠的主要臟器和腫瘤組織進行成像。通過成像系統的處理軟件獲取成像的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）和腫瘤背景比（tumorto-background ratio，TBR），其中TBR是腫瘤處的MFI除以同側大腿處的MFI。

八、統計學分析

采用GraphPad 7.0進行數據統計和分析。所有獲得實驗結果的連續變量數據用平均值±標準差來表示。采用t檢驗來比較兩組數據的差異。P ＜ 0.05被認為差異具有統計學意義。

結 果

一、數據庫中c-Met的表達情況

在TCGA數據庫中，發現MET的表達水平在大多數腫瘤中都高于正常組織，其中在肝癌組織中顯著高于正常肝組織（P ＜ 0.001） （圖1A、1B）。此外，在HPA數據庫中發現c-Met在大多數腫瘤組織中都高表達，其中在肝癌中的表達率為80%（圖1C）。

圖1 數據庫中c-Met的表達分析

二、肝癌細胞系中c-Met的表達分析

通過Western Blot分析人肝癌細胞系的c-Met表達情況（圖2A、2B），發現肝癌細胞系SK-Hep1、Hep 3B 和SMMC7721都有不同程度的c-Met表達， 而卵巢癌A2780不表達c-Met。以上細胞系可用于后續探針的特異性結合能力研究。

圖2 人肝癌細胞系中c-Met的表達分析

三、SHRmAb-IR800的體外特異結合能力檢測

將抗體探針與腫瘤細胞共孵育后，進行流式細胞術分析，可見SHRmAb-IR800與各腫瘤細胞的結合程度與其c-Met的表達水平呈正相關性（圖3A）。另外，將抗體探針和抗體分別與SKHep1肝癌細胞共孵育，發現SHRmAb-IR800和SK-Hep1細胞的結合，與抗體SHRmAb相比無顯著性差異，但高于對照組（IgG2-IR800和IgG2）（圖3B）。以上結果表明，SHRmAb-IR800探針能夠特異結合c-Met陽性肝癌細胞。

選擇SK-Hep1進行共聚焦成像實驗（圖3C），在0℃ 孵育30 min后可見SHRmAb-IR800濃聚于肝癌細胞膜上；提高孵育溫度至37℃之后，發現探針被肝癌細胞攝取入胞質內，說明SHRmAb-IR800能夠與c-Met陽性的肝癌細胞結合并被攝取。

圖3 SHRmAb-IR800的體外結合能力分析

四、SHRmAb-IR800在動物模型中的活體成像分析

利用SK-Hep1構建肝癌皮下模型，14 d后可用于活體成像。如圖4A、4B可見，隨著時間的推移，SHRmAb-IR800成像的MFI逐漸升高，并且于24 、72和96 h可見，SHRmAb-IR800組的MFI均顯著高于對照組IgG2-IR800 （P ＜ 0.05）。此外，在96 h時SHRmAb-IR800的TBR為（2.01 ± 0.18），顯著高于 IgG2-IR800（1.59 ± 0.10，P ＜ 0.05）。

圖4 SHRmAb-IR800在SK-Hep1肝癌皮下模型中的活體成像分析

于肝癌皮下瘤模型活體成像的96 h，收集其皮下瘤組織和主要臟器進行近紅外熒光成像（圖5A），以分析SHRmAb-IR800在小鼠體內的分布情況。通過成像的定量分析（圖5B），可見SHRmAb-IR800靶向聚集于腫瘤組織，高于正常皮膚和肌肉組織（P ＜ 0.05），并且也高于對照IgG2-IR800的腫瘤組織（P ＜ 0.05）。另外，將腫瘤組織進行免疫組化染色，顯示為c-Met陽性（圖6）。

圖5 SHRmAb-IR800在SK-Hep1肝癌皮下瘤模型中的離體成像分析

圖6 SK-Hep1肝癌皮下瘤的c-Met免疫組化染色分析，比例尺：200 μm & 100 μm

以上實驗結果說明，該近紅外熒光探針SHRmAb-IR800能夠特異性靶向聚集于c-Met陽性的肝癌組織。

討 論

手術切除是根治肝癌的最主要方式之一，但由于肝癌浸潤邊界難以在術中界定，且毗鄰腹腔重要器官，病灶少切一分導致高術后復發率，而多切一分導致嚴重術后并發癥，因此提高術中肝癌邊界的分辨率是提高患者術后生存質量的關鍵。目前靶向近紅外熒光成像為術中腫瘤病灶的精準識別和完整切除帶來了重要的契機[19]。如：2011年，靶向葉酸受體的小分子熒光探針（葉酸-FITC）用于人體卵巢癌手術切除的臨床研究，其有利于改進術中分期和腫瘤細胞減滅術，從而改善患者的預后[20]；2014年，靶向c-Met多肽與熒光染料Cy5偶聯的熒光探針GE-137用于人體結腸息肉癌變鏡檢的臨床研究，其可提高患者的結腸癌及其癌前病變的檢出率，從而有利于結腸癌的早診斷和早治療[21]。然而，上述熒光探針的發射波長較短，以致其成像易受自體熒光干擾，且信噪比低、組織穿透力差，并且小分子和多肽探針的體內半衰期短、靶向能力較弱，因此臨床應用受限。為了克服以上探針的局限性，本研究利用基于人源化c-Met抗體和近紅外熒光染料IRDy800CW合成的熒光探針SHRmAb-IR800，以分析其對于人源肝癌細胞株和肝癌皮下瘤模型的靶向聚集能力，為肝癌精準診療探索一種新的輔助手段。

本研究的體內外實驗均說明，近紅外熒光探針SHRmAb-IR800能特異性識別c-Met陽性的肝癌腫瘤，有助于肝癌的檢測，在手術導航方面具有潛在應用價值。首先，SHRmAb-IR800的發射光譜在750～850 nm范圍，與染料FITC和Cy5偶聯的探針相比（520～670 nm），具有較少的自體背景熒光干擾和更高的信噪比[5,22]。另外，SHRmAb-IR800在96 h的成像TBR（2.01 ± 0.18）顯著高于對照探針組，并且大量研究表明，當探針的TBR大于2時，則具有較高的腫瘤對比度，提示該探針有助于腫瘤組織和正常組織的辨別[23]。其次，SHRmAb-IR800是利用靶向c-Met的單克隆抗體構建的，與多肽探針相比，具有較高親和力（Kd = 1.07 ±0.05）[18]，能特異性聚集于c-Met陽性的肝癌細胞和組織，并且SHRmAb-IR800在c-Met陽性肝癌中的濃聚程度顯著高于對照探針（P ＜ 0.05），有利于肝癌的精準診斷。最后，SHRmAb-IR800具有良好的生物安全性。本研究所用的抗體是已經進入臨床Ⅰ期試驗的抗體結合藥物中的抗體（SHRmAb），無抗體依賴的細胞毒性作用和補體依賴的細胞毒性作用，對機體組織不產生毒副作用[24-25]；而所用熒光染料（IRDye800CW）的體內代謝情況和安全性已被大量研究驗證，并且與抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗和貝伐單抗等）偶聯形成的抗體探針也被用于腫瘤的手術導航臨床試驗，具有較好的人體安全性[10]。綜上所述，本課題構建的近紅外熒光探針SHRmAb-IR800在肝癌的手術導航中具有一定的臨床轉化潛能。

本研究還存在一些改進的地方。首先，于96 h時，離體成像結果顯示SHRmAb-IR800在肝臟中有累積，可能會干擾肝癌原發病灶的辨別，從而限制其在肝癌手術導航的應用。為了獲得抗體探針的最優成像對比度，可適當延長成像時間至4～7 d[26-29]，因此本研究可進一步延長SHRmAb-IR800的成像時間，以獲得最佳的信噪比；另外，還可以進一步優化該分子探針，以減少正常肝臟攝取，從而提高原發肝癌的成像對比度。其次，目前近紅外二區熒光成像具有更低的光子散射、更高的空間分辨率和更優的信噪比，在生物成像領域得到了廣泛的應用[30-31]。有研究表明，IRDye800CW染料的發射光譜也能達到近紅外Ⅱ區窗口，因此可利用近紅外Ⅱ區的成像儀器進行研究，從而進一步發掘該探針對肝癌手術導航的應用價值。最后，有研究表明c-Met的表達水平與患者的治療抵抗和預后差正相關[32-33]，因此c-Met的靶向分子成像將有利于肝癌的治療監測和預后評估。

綜上，靶向c-Met的近紅熒光抗體探針SHRmAb-IR800能夠特異識別c-Met陽性肝癌腫瘤，并且在成像96 h具有良好的TBR，這將有利于精準的肝癌可視化手術切除，做到“不多切正常肝組織，不少切肝癌組織”，從而提高患者的生存質量。