建立一種醫療器械材料體外激活血小板的新方法

楊文潤 莫曉彥 楊立峰 許建霞 鄭保婷 祝冰倩 南方 潘賢珮

1 廣東省醫療器械質量監督檢驗所 （廣東 廣州 510080）

2 中國食品藥品檢定研究院 （北京 102629）

內容提要： 醫療器械材料對血小板的激活與其表面性質、接觸面積、接觸時間和血小板的濃度等因素有關。首先使用家兔血液分別與不同的醫療器械材料進行接觸反應，然后檢測醫療器械材料接觸血液后其血小板數量和形態學指標的變化，并在顯微鏡下觀察分析血小板的數量和形態以對檢測結果作進一步的確認和驗證。最后統計分析血小板數量的變化和形態學的變化并且進行關聯，從而建立一種醫療器械材料體外激活血小板的新方法，可以更科學、更準確地反映出醫療器械材料激活血小板的情況。

醫療器械材料（以下簡稱：材料）與血液相互作用后導致的血小板激活是血液相容性評價的重要內容[1-2]，血小板計數（PLT）是評價血小板激活的常用方法。血小板計數減少的基本原理是因為血小板粘附在材料表面或者是血小板聚集或者激活發生了不可逆轉的形態學改變，有文獻和標準[1,3]指出血小板粘附不一定就意味著血小板活化，即粘附在材料表面的血小板不一定會被激活。作者認為血小板粘附在材料表面是正常血小板的一個正常的生理功能，血小板粘附在材料表面的影響因素有很多，除了材料本身還容易受到血液的狀態、抗凝劑的使用、試驗的條件等因素的影響。因此單一的血小板計數試驗存在局限性，不足以科學、準確地評價材料對血小板的影響[3-7]。

一般情況下，血小板被激活后可伸出偽足發生形態學改變，血小板之間可融合成粘性變形的血小板[8,9]。Kunicki和Mitrovic[4,5]等提出了在顯微鏡下應用血小板形態學計分可以評價血小板的激活程度。臨床上平均血小板體積大?。∕PV）是血小板功能和活化的標志，在血栓性疾病的病理生理機制中起著重要的作用[6,7]；血小板平均體積分布寬度（PDW）是反映血小板體積異質性的參數，它是反應血小板激活狀態的敏感指標[9]。大血小板比率（P-LCR）是評價血小板形態的重要參數[10]，與血栓性疾病發生有密切關系[11,12]。

1.材料與方法

1.1 一般材料

血液來源：普通級家兔（廣東省廣州市白云區龍歸興科實驗動物養殖場）。

儀器與試劑：全自動血液分析儀XT-2000i（希森美康醫用電子（上海）有限公司），徠卡顯微鏡DM2500（德國徠卡儀器（中國）有限公司），旋轉培養器（太倉市實驗設備廠），隔水式恒溫培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）；3.2%檸檬酸鈉抗凝劑（上海源葉生物科技有限公司），10%EDTA-K2抗凝劑（上海源葉生物科技有限公司），一次性使用真空采血管（江蘇康健醫療用品有限公司）。

1.2 方法

編號A～G共7組，每組設3個平行管，所有組別材料制備條件一致，取樣原則和比例按標準要求進行，制備完成后裝入一次性使用真空采血管[12,13]。A組（A1～A5）：陰性材料組，長寬高約為（3.2×2.4×1.2）mm的低密度聚乙烯粒料（Low-Density Polyethylene，LDPE），A1～A5表面積：6cm2、12cm2、18cm2、24cm2、36cm2；B組（B1～B5）：陽性材料組，直徑約2.0mm玻璃珠，B1～B5表面積與A組一致；C組（C1～C2）：C1組取0.2g空心纖維膜Ⅰ，C2組取0.4g空心纖維膜Ⅰ；D組（D1～D2）：D1組取0.2g空心纖維膜Ⅱ，D2組取0.4g空心纖維膜Ⅱ；E組：取0.4g樹脂顆粒Ⅰ；F組：取0.4g樹脂顆粒Ⅱ；G組：空白組，不添加任何材料。

選用健康、成年的普通級家兔，使用3.2%檸檬酸鈉抗凝劑，按血液與抗凝劑體積9:1的比例進行抗凝，通過心臟采血，置于塑料管中，充分混勻后備用。

實驗前每個采血管加入適量生理鹽水濕潤管壁和材料，然后每個采血管加入2.0mL新鮮抗凝兔血，充分混勻后將所有采血管置于隔水式恒溫培養箱的旋轉培養器上，在37°C條件下動態接觸孵育。孵育結束后向每個采血管加入EDTA-K2抗凝劑40μL以終止血小板的反應，再次混勻分離材料取血液，取血液后涂制成血涂片進行瑞氏染色，最后用全自動血液分析儀測定各管血液中PLT，MPV，PCT，PDW和P-LCR等指標[8,14]。

根據標準中對血小板激活對照材料的要求，陽性材料需與空白對照的PLT百分比（A%）需降低到50%以下、陰性材料需與空白對照的PLT百分比（B%）在80%～100%，實驗方法體系方可成立[14]。試驗數據采用SPSS19.0進行統計學分析，數據使用±s表示。血涂片使用顯微鏡在油鏡下觀察血小板的形態（Microscopic platelet morphology，MPM）。

2.結果

2.1 材料表面積對PLT及P-LCR數值變化的影響

接觸血液后A、B兩組材料的PLT及P-LCR見圖1、圖2。B組表面積超過12cm2時，PLT下降數值超過50%，直至形成血栓；P-LCR隨著表面積增加數值一直上升，在表面積超過12cm2后趨于穩定。A組數值隨表面積增加雖有下降，但總體仍保持在80%以上；P-LCR基本無變化。

圖1. 不同表面積A組和B組的PLT數量變化

圖2. 不同表面積A組和B組的P-LCR的比值變化

2.2 接觸時間對PLT及P-LCR數值變化的影響

圖3中可見A1組、G組各時間點PLT在統計學上無顯著性差異（P＞0.05），受接觸時間的影響較??；B1組則隨時間延長PLT一直下降直至形成血栓；圖4中可見G組P-LCR無明顯波動，A1組與B1組則隨時間變化會出現波動，B1組更明顯。

圖3. 不同時間下A1組、B1組、G組的PLT數量變化

圖4. 不同時間下A組、B組、G組的P-LCR的比值變化

2.3 不同濃度PLT接觸材料后PLT及P-LCR的變化

表1中可見，當PLT濃度較高（＞300）時，B%可以降到50%以下，P-LCR顯著升高；A組材料與接觸前P-LCR基本保持一致，A%穩定在80%以上。

表1. 不同的PLT接觸玻璃珠后PLT和P-LCR的變化

2.4 各組材料接觸60min后血小板及MPM的變化

表2中PLT相比G組下降一半或以上的組別，P-LCR數值均發生明顯變化，以B1、C1、C2上升得最為明顯；圖5為G組MPM，可見少量血小板聚集狀分布，顆粒區染色較深且相對致密；圖6為B1組MPM，可見血小板呈橢圓形，常見聚集狀分布，樹突型血小板伸出偽足彼此間相互聚集呈團簇狀分布，相比較于G組血小板體積較大，顆粒區染色淺且疏松。

表2. 不同的材料接觸血液后血小板指標的變化

圖5. G組材料的MPM

圖6. B1組材料的MPM

3.討論

當材料與血液相互接觸后，血液中的血小板可粘附在材料表面，且可激活血小板，使血液向著血栓形成的方向發展[1,2,14,15]。血小板激活可以是材料的表面性質導致[1,2,15]，材料表面性質的改變可誘導血小板的激活[16-18]。

圖表的統計數據表明，當陽性材料的接觸時間或接觸面積逐漸增加時，PLT會逐漸降低，達到一定程度時可導致血栓形成的現象。陰性材料P-LCR受接觸面積影響較小，陽性材料P-LCR受接影響最大。P-LCR隨著接觸面積和接觸時間分別達到6cm2/mL和60min時，P-LCR可達到相對平穩的高值。加入EDTA-K2后，粘附聚集在材料上的血小板被解聚散開，血液中的PLT隨即回升，血小板粘附在材料表面在一定情況下是可逆的，可見血液中PLT降低未必與血小板的激活有關。

圖表的統計數據表明，陽性材料隨著接觸時間或接觸面積的增加，血小板有逐漸被激活的趨勢，在統計數據上可見MPV、PDW、P-LCR均有不同程度升高。血小板激活達到一定程度后加入EDTA-K2，上述指標仍保持穩定，由此可見血小板被激活后，血小板發生了粘附、聚集到形態學的改變，血小板最終發生了交聯纖維蛋白和其它血細胞，此過程血小板粘附解聚不可逆。

目前使用血液分析儀檢測血小板數量也存在一定的局限性。例如，材料接觸血液后，電阻抗法檢測容易導致血小板假性增高；選擇的不當的抗凝劑，血小板也容易發生假性聚集，光學法檢測也無法消除其影響[15,19,20]。對于MPM，血細胞的形態學分析在臨床診斷中具有重要的參考價值，甚至被認為是一些診斷的金標準[8，21]。但MPM也存在制片染色、觀察選點及個人主觀性等問題。因此本研究檢測分析血小板數量和形態學指標的變化，并在顯微鏡下觀察分析血小板的數量和形態以對檢測結果作進一步的確認和驗證，從而建立一種醫療器械材料體外激活血小板的新方法，可以更科學、更準確地反映出醫療器械材料激活血小板的情況。

目前使用血液分析儀檢測血小板數量以評價材料的血液相容性存在一定局限性。如電阻抗法會存在血小板假性增高；當血小板聚集時，光學法也無法消除對血小板計數的影響[15,19,20]。對于MPM，血細胞的形態學分析在臨床診斷中具有重要的參考價值，甚至被認為是一些診斷的金標準[8,21]。但MPM亦存在涂制片、選觀察點及主觀性等問題。因此本研究采用兩者聯合進行相互驗證和補充，使得到的結果更為全面準確。