兩種隱球菌莢膜多糖抗原試劑盒在肺隱球菌病診斷的比較分析

謝春紅 黃連江 廈門醫學院附屬第二醫院 （福建 廈門 361000）

內容提要： 目的：探討隱球菌莢膜多糖抗原膠體金免疫層析法（CrAg-LFA）檢測在非人類免疫缺陷病毒（HIV）患者肺隱球菌?。≒C）的診斷價值，比較進口與國產CrAg-LFA試劑在非HIV患者PC患者不同樣本中的敏感性。方法：回顧性研究2018年1月1日～2020年12月31日本院呼吸中心收治的518例非HIV疑似PC患者。用兩種不同廠家的CrAg-LFA試劑盒檢測篩查患者血清和肺泡灌洗液（或防污染保護性毛刷樣本、肺穿組織）中的隱球菌莢膜多糖抗原（CrAg），對比兩種試劑盒在診斷PC時的敏感性和特異性。結果：確診的78例PC患者血清進口試劑檢測60例陽性，18例陰性；其中進口試劑血清CrAg-LFA檢測的敏感性為76.92%，特異性為100%。國產試劑血清CrAg-LFA檢測的敏感性為79.49%，特異性為100%。1.兩種試劑的敏感性和特異性差異無統計學意義（χ2=0.150，P＞0.05）2.血清標本的敏感性大于肺泡灌洗液標本。結論：CrAg-LFA具有準確率高、快速簡便的特點，為PC的快速、早期診斷提供重要依據。國內試劑盒和進口試劑盒在非HIV肺隱球菌患者中不同標本的檢測結果無顯著差異。

肺隱球菌?。≒ulmonary Cryptococcosis，PC）是一種由隱球菌感染引起的肺部真菌病，隱球菌易播散至中樞神經系統而導致隱球菌性腦膜炎，病死率，致殘率高。近年來多研究顯示，非HIV人群中PC的發病率呈快速增長趨勢[1]。CrAg-LFA簡單、快速、特異性高、靈敏度高，血清CrAg-LFA檢測已廣泛運用于臨床以輔助隱球菌病的感染。原來國內臨床實驗室采用都是進口試劑，近年來多家國產試劑不斷運用在臨床中。本研究回顧性分析過去本院三年來疑似PC患者的資料，探討CrAg-LFA檢測不同標本在非HIV患者PC的診斷價值，比較兩種不同試劑盒在非HIV肺隱球菌患者不同標本的敏感性和特異性。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年1月1日～2020年12月31日本院研究最終確診的PC患者78例，患病年齡為23～76歲，平均（44±15.2）歲，其中男性52例（66.7%），平均年齡（47±12.4）歲，女性26例（33.3%），平均年齡（39±11.5）歲，男女患病年齡沒有統計學差異，此次回顧性研究顯示，PC的發病率，男性高于女性，因數據基數小不具有代表性?；颊咧杏谢A疾病的占36例（46.2%），包括慢性阻塞性肺病、類風濕關節炎、糖尿病、痛風性關節炎、高血壓病、慢性乙型病毒性肝炎、肺結核、腦梗死、系統性紅斑狼瘡、鼻咽癌放療后，無基礎疾病42例（53.8%）。追問病史半年內有鴿子接觸史5例。

儀器與試劑：美國Immuno-Mycologies有限公司生產及浙江溫州康泰生物有限公司生產的CrAg-LFA試劑；法國生物梅里埃有限公司生產的真菌YST鑒定卡；美國賽默飛公司生產的Versa TREK全自動血培養儀；鄭州安圖生物有限公司生產的平板。

1.2 方法

1.2.1 IMMYCrAg-LFA檢測。常規無菌操作方法收集全血無菌樣本，3000r/min離心10min，分離血清，小試管內加入一滴樣本稀釋液，再加入40μL血清，充分混勻，插入試紙條，放置10min，讀取結果。出現一條質控線為陰性，質控線與檢測線同時出現為陽性，只出現檢測線而無質控線則檢測失敗。肺泡灌洗液（BALF液）、防污染保護性毛刷樣本（PSB樣本）、肺穿組織（經研磨后）的檢測操作參照血清標本進行操作。

1.2.2 溫州康泰CrAg-LFA檢測。常規無菌操作方法收集全血無菌樣本，3000r/min離心10min得到待測血清后，將待測樣本及檢測試劑盒置于室溫平衡，移取40μL樣品稀釋液到試管中，然后抽取40μL樣品并與稀釋液混合，再使用移液器在稀釋后抽取60μL樣品，并將其添加到測試卡的孔中。等待20min，然后判定結果，出現一條質控線為陰性，質控線與檢測線同時出現為陽性，只出現檢測線而無質控線則檢測失敗。BALF液、PSB標本、肺穿組織（經研磨后）操作參照血清標本進行操作。

1.2.3 病理檢查。CT引導下經皮肺穿刺活檢，組織固定包埋、切片，HE染色及特殊染色。

1.2.4 血培養。采集患者血液進行培養，或CT引導下取肺穿刺物，經玻璃組織研磨器研磨注入血培養瓶并上機培養，陽性瓶立刻用血瓊脂平板和沙保羅平板轉種，生長后挑取疑似隱球菌的菌落用YST卡鑒定。

1.2.5 鏡檢和真菌培養。由臨床醫生收集BALF液、PSB樣本及肺穿組織（經研磨）。標本經3000r/min離心10min可直接涂片革蘭染色；同時用濕片進行墨汁染色；接種血瓊脂平板和沙保氏平板，放入35°C培養箱中培養5d，生長并分純后用YST卡片進行鑒定。

1.3 統計學分析

檢測方法間的比較采用χ2檢驗，P＞0.05無統計學差異。

2.實驗室結果

2.1 BALF、PSB標本或肺穿刺組織標本墨汁染色結果

由臨床醫生氣管鏡下收集肺泡灌洗液（BALF）和防污染保護性樣本毛刷（PSB）樣本，CT定位下穿刺取得肺穿標本（經研磨），3000r/min離心10min，沉渣進行墨汁染色，如在黑色背景鏡下可見圓形孢子，周圍有一較寬的折光性強的厚莢膜，判斷為陽性如下圖1、圖2，78例確診患者中有14例墨汁染色陽性，陽性率23.1%。

圖1. 不同濃度墨汁染色下的隱球菌

圖2. 不同濃度墨汁染色下的隱球菌

2.2 BALF液、PSB標本或者肺穿組織標本真菌培養結果

BALF、PSB標本及肺穿組織（經研磨后）接種于沙保羅平板，放入35°C培養箱內，生長后分純，可疑菌落用梅里埃的YST卡鑒定。培養出20例隱球菌，通過菌株鑒定，15例為格特隱球菌，其余5例為新生隱球菌。

2.3 氣管鏡下活檢組織或者肺穿刺標本的病理結果

在本次回顧性研究中，78例患者的病理標本的報告中只報告12例隱球菌，肺組織標本中，病理學大部分表現出慢性肉芽腫性炎，肉芽腫由泡沫細胞、上皮樣組織細胞、多核巨細胞聚集等構成，常規切片HE染色可以見到呈明顯的圓形結構的隱球菌，直徑大小大約2～15μm，有白色莢膜，糖原染色莢膜可呈淡紅色（見圖3）。

圖3. 肺穿組織糖原染色下的隱球菌

2.4 CrAg-LFA檢測結果

兩組患者的BALF液、PSB標本或者肺組織標本檢測CrAg-LFA，判斷標準參照圖4，CrAg-LFA結果見表1，血清標本進口試劑CrAg-LFA檢測的敏感性為76.92%，國產試劑CrAg-LFA檢測的敏感性為79.49%，兩者的特異性均為100%，BALF液進口試劑CrAg-LFA檢測的敏感性為65.38%，國產試劑CrAg-LFA檢測的敏感性為62.82%，兩者的特異性均為99.7%。①進口試劑和國產試劑檢測CrAg結果未見明顯差異，無統計學意義（χ2=0.150，P＞0.05），結果見表2。②進口試劑血清標本的敏感性大于肺泡灌洗液標本的敏感性，差異無統計學意義（χ2=2.530，P＞0.05），結果見表3。國產試劑血清標本的敏感性大于肺泡灌洗液標本的敏感性，差異有統計學意義（χ2=5.278，P＜0.05），結果見表4。

表1. 兩組患者兩種標本兩種隱球菌莢膜膠體金試劑檢測結果及隱球菌培養結果(n)

表2. 兩種試劑血清標本隱球菌莢膜膠體金試劑檢測結果

表3. 進口試劑血清和BALF隱球菌莢膜膠體金試劑檢測結果

表4. 國產試劑血清和BALF隱球菌莢膜膠體金試劑檢測結果

圖4. 進口和國產膠體金試劑陽性檢測結果

3.討論

近年來PC的報道例數顯著增高，是僅次于念珠菌、曲霉菌的第三大類肺真菌病。越來越多的國內、外研究表明近年來隱球菌病在健康人群中的發病率逐年上升，PC在非HIV人群中的發病率甚至超過免疫缺陷患者的發病率，免疫功能正常的PC患者高達62.8%[3]。在非HIV人群中PC發病隱匿，無臨床癥狀，影像學表現沒有特異性，血培養、痰培養真菌檢出率偏低，有時很難和肺結核、細菌性肺炎、肺癌等疾病相鑒別，誤診率高[4]。本研究對本院2018年1月1日～2020年12月31日的78例非HIV患者確診PC進行回顧性分析。其中高達53.8%的患者無基礎疾病，與既往報道相符，42例無任何臨床癥狀，僅體檢時CT發現胸部異常入院，這就考慮隱球菌有相當的毒力，臨床需要加強對PC的認識，在健康人群發現肺部疾病時也要考慮隱球菌病的可能性，爭取做到早發現、早診斷、早治療。

感染性疾病主要通過病原學和病理學檢查確診，PC也是如此。PC目前主要依靠肺組織病理檢查或者通過血液、BALF液、PSB標本或肺穿刺標本培養出隱球菌，雖然特異性高，但是靈敏度低，而且需要較長時間，并且多為有創性檢查，標本獲取較難。有研究表明對于診斷隱球菌病，CrAg檢測敏感性遠高于鏡檢或者培養或者病理。本研究中只有14例陽性墨汁染色，真菌培養只有20例陽性，與以往相符。這是既往PC誤診率高的主要原因。本研究中的患者常見的感染性指標如白細胞總數、中性粒細胞百分比、C反應蛋白幾乎都正常，所有患者的降鈣素原也都正常。莢膜多糖是隱球菌的主要毒力因子，它可以抑制中性粒細胞的吞噬，削弱T細胞的免疫應答。CrAg檢測主要用于檢測腦脊液標本、血清標本中的CrAg，它包括乳膠凝集試驗（LA法）、酶聯免疫法，膠體金法（LFA）等，CrAg-LFA是一項側向層析檢測技術，國外有研究顯示，此法對隱球菌病的敏感度和特異度高達93%～100%，敏感性比LA法高100倍，因此被FDA批準用于血清標本和腦脊液標本的檢測。近年多項報道提出膠體金免疫層析法具有人員資質要求低，室溫穩定，便捷準確，優于其他學方法，成為檢測隱球菌抗原的首選方法[5]。隨著膠體金試劑盒的廣泛使用，使得PC的檢出率劇增。血清隱球菌莢膜多糖抗原檢測對診斷PC具有較高的敏感性和特異性。從本研究進口試劑和國產試劑在78例非HIV PC患者血清標本的結果來看，兩者的敏感性和特異性無顯著差異。