非洲豬瘟病原學檢測技術研究進展

王 翠，許宗麗，黃溢泓，覃艷然，梁競臻，周師師，劉針伶，黃小武，馬小蓉，李志源，嚴斯剛

（柳州市動物疫病預防控制中心，廣西柳州 545005）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染豬引起的一種熱性急性傳染性疫病，臨床癥狀表現為體溫高熱、皮膚充血、多器官出血及流產等癥狀[1]。ASFV 是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridate）的唯一一種病毒，也是唯一一種蟲媒傳播的雙鏈線性DNA 病毒，以直接或間接接觸以及軟蜱吸血途徑傳播，僅感染豬科動物（不同生長階段、品種的豬均易感）[2]。ASFV 是大型、似六角形、復雜的二十面體帶囊膜的雙鏈線性DNA 病毒，直徑172～260 nm，基因組全長170～194 kb，其病毒顆粒是由3 萬余個蛋白亞基，17 280 種蛋白質組裝成的球形顆粒，是目前解析近原子分辨率結構中最大的病毒顆粒[3]。ASFV 根據病毒是否具有紅細胞吸附特性，已鑒定出8 個血清群，依據編碼p72 蛋白的B646L基因的3′端序列，目前全球已鑒定出至少24 種基因型，其中歐洲流行I 型和II 型[4]。強毒力基因II 型2018 年傳入我國，隨后蔓延至全國，2021 年2 月Sun 等[5]在我國發現基因II 型自然低毒力毒株，其基因序列發生了不同程度的突變或缺失，導致毒株致病性降低，有明顯的殘留毒力，引起的臨床癥狀也具有明顯的隱蔽性；2021 年10 月Sun 等[6]從山東和河南兩省豬場臨床發病豬樣品分離出兩株基因I 型毒株，經動物攻擊試驗發現，其表現出低毒力和有效傳播能力，并可導致輕度感染和慢性疾病，而感染這些低毒力毒株的豬不斷排出病毒并出現低水平的病毒血癥，排毒及病毒血癥規律性較差，這給ASF 的早期診斷和防控帶來巨大障礙。為更好地給ASF 早期診斷和防控提供幫助，就當前的ASFV 病原學檢測技術研究進行了概述。

1 活病毒檢測

活病毒檢測主要有病毒分離（virus isolation，VI）和紅細胞吸附試驗（hemadsorption，HAD）。VI 鑒定結合HAD 是世界動物衛生組織（OIE）確診ASF 的“金標準”之一。VI 是將ASFV 從豬血液、肺（肺泡）單核細胞或巨噬細胞中分離出來，鏡下觀察是否有細胞病變效應（cytopathic effect，CPE）；HAD 是根據紅細胞聚集在ASFV 感染的巨噬細胞周圍，觀察細胞表面是否有“玫瑰花環”或“桑葚狀”現象[7]。但這些方法試驗周期較長，所需設備昂貴，對技術人員素質、實驗室生物安全條件等方面要求較高，必須在具有生物安全三級以上實驗室中進行，且目前只有少數實驗室能從事ASFV 分離、鑒定、活病毒培養、動物接種試驗等，因此并不適用于現場檢測，通常適用于ASFV 致病機制和分子生物學表征的研究及疫苗的研發。

ASFV 分離最早使用豬原代巨噬細胞，且必須是豬身上的新鮮分離的血液才行，而大多數獸醫診斷實驗室通常是不易獲得的。Rai 等[8]從非洲綠猴腎上皮細胞中分離到商業化的細胞系MA-104（猴胚胎腎細胞），能從不是新鮮的血液樣品中檢測ASFV，其靈敏度與原代豬巨噬細胞相當。近期又有文獻報道[9]，ASFV 能在ZMAC-4（胎豬肺巨噬細胞）、WSL（野豬肺細胞）和IPKM（豬腎巨噬細胞）中高效復制，這些可替代的細胞能節省大量的前置時間。而1963 年Tubiash 等[10]在西班牙首次發現ASFV 不吸附紅細胞。2021 年Sun 等[5]在我國分離出22 株自然變異株，其中有11 株因基因突變或缺失阻止病毒翻譯完整的CD2v 蛋白，導致病毒粒子失去吸附紅細胞表型的能力。因此，不具有紅細胞吸附現象的ASFV 毒株，并不適用于此方法來進行鑒定，進一步確診需要對病毒分離培養物采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）等方法進行檢測鑒定。

2 病毒核酸檢測

病毒核酸檢測是針對ASFV 核酸序列的，常用方法有PCR、qPCR、微流控芯片法、等溫擴增技術，其中PCR 和qPCR 是OIE 推薦的首選確診技術。不同方法有其各自的特點，具體見表1。

表1 常用ASFV 核酸檢測方法比較

2.1 PCR

從發明到現在，PCR 方法被不斷改進和優化，已成為實驗室病原學檢測常用方法之一，也是OIE推薦的ASF 診斷方法之一。Agüero 等[11]針對編碼p72 蛋白的B646L基因保守區域設計了一對特異性引物，建立了ASFV PCR 檢測方法。該方法擴增片段大小為257 bp，使用的引物是OIE 推薦使用的引物之一。為了建立一種便捷、快速且精準的ASFV 檢測方法，李艷等[12]根據ASFV p72 蛋白基因序列設計特異性引物，建立了ASFV 鎖核酸修飾引物PCR 檢測方法。該方法具有良好的敏感性和特異性，檢測靈敏度可達3×101copies/μL，比常規PCR 方法提高了100 倍，比qPCR 方法提高了10 倍。用該方法檢測了72 份臨床樣品，其結果與OIE 推薦的qPCR 方法檢測結果一致，符合率為100%。

因動物疫病的復雜化，ASFV 多與其他病原混合感染，引起的臨床癥狀不典型，無法與其他疫病區別。為了快速診斷豬只感染狀況，Liu 等[13]針對ASFV、豬瘟病毒和非典型豬瘟病毒的高度保守區域設計了3 對特異性引物，建立多重PCR 檢測方法用于臨床樣本的鑒別診斷。該方法特異性強、靈敏度高，且對樣品保存方式要求較低，但對技術人員操作要求高，不適于現場檢測。

2.2 qPCR

相比于普通PCR，qPCR 在普通PCR 基礎上引入了光譜技術，通過熒光信號的強弱變化，定量實時監測PCR 反應的整個過程，最后通過擴增曲線和反應特異性擴增產物的量（Ct）來判斷樣品的陰陽性。該方法的特異性、靈敏性都超過普通PCR，且自動化程度高，不易污染，是目前公認的金標準之一。

為了防止基因錯配而導致檢測不準確，Yang等[14]針對B646L和B438L基因的保守區設計了2組特異性引物和2 個TaqMan 熒光探針建立了雙重qPCR。該方法的檢測限為10 copies/μL。用180 份ASFV 臨床感染樣本，將其與商品化試劑盒進行檢測比較，結果兩種方法具有良好的一致性（98.3%），因而該方法可以極大提高ASFV 檢測效率。為了鑒別檢測ASFV 的野生型毒株和基因缺失毒株，韓勇軍等[15]根據ASFV 的P72、CD2v、MGF360-14L基因保守序列設計了特異性引物和探針，建立了一種可以同時檢測上述4 種基因的多重熒光定量PCR 方法。該方法的最低檢測限為100 copies/mL。用該方法與ASFV 核酸檢測試劑盒對35 份臨床樣品進行檢測，結果陽性符合率為100%。該方法的建立對ASFV 的鑒別檢測、病原流行病學調查等具有重要意義。為了快速檢測出越南ASFV 流行毒株，Trinh 等[16]針對編碼p54 蛋白的E183L基因建立一種新型qPCR 方法。該方法檢測限為2.63 copies/μL，能夠檢測根據P72基因分型的I、II 和V 的15 種不同ASFV 參考毒株，為ASF 防控提供了一種新的檢測方法。

qPCR 檢測技術靈敏，極其微量的污染即可造成假陽性，所以對于PCR 實驗室，應根據條件實施試劑準備區、樣本制備區、產物擴增區等分區管理，同時也要注意由于引物和探針的錯配及選擇的試劑盒不夠敏感等原因導致的假陰性結果，所以一次檢測的陽性和陰性結果均需謹慎評價，最終確診需結合臨床和流行病學指標，必要時可采取基因測序或者其他平行試驗[17]。

2.3 微流控芯片法

微流控芯片技術是將樣品前處理、反應、分離及檢測等過程集成到幾平方厘米的芯片上，自動完成分析全過程，實現了分析微型化、自動化、集成化和便攜化的一種新技術[18-19]。Jia 等[20]針對ASFV 的B646L基因設計了一對特異性引物，結合探針建立了納米微流控數字PCR。該方法的檢測限為30.19 copies/mL，比OIE 推薦的qPCR 高約33 倍。用該方法與OIE 推薦的qPCR 同時檢測69份滅活的臨床血清樣本，發現兩種方法具有良好的一致性（91.30%）。為評估微流控芯片法在ASFV核酸快速檢測中的效果，邵靚等[21]用ASFV 微流控芯片快速檢測試劑盒和市場上ASFV qPCR 檢測試劑盒，對43 份臨床樣本進行檢測比對，發現微流控芯片法可以在15～30 min 內檢出，最低檢出限為2.5 copies/uL，與qPCR 具有良好的一致性（97.67%）。該方法具有樣品消耗少、檢測速度快、操作簡便、便于攜帶等優點，但需要特定的設備，檢測成本高，難以被推廣。

2.4 等溫擴增技術

等溫擴增技術是一種新興的分子生物學核酸檢測方法，有環介導等溫擴增（loopmediated isothermal amplif ication，LAMP）、重組酶聚合酶等溫擴增（recombinase polymerase amplif ication，RPA）、重組酶介導等溫擴增（recombinase aided amplif ication，RAA）和酶促重組酶擴增（enzymatic recombinase amplif ication，ERA）4 種。等溫條件下，在特異性引物、酶等物質的作用下實現體外核酸擴增，再結合瓊脂凝膠電泳、實時熒光和測流層析試紙條以及規律成簇的間隔短回文重復（clustered stered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）4 種方式，可呈現檢測結果。Yang 等[22]針對p72 蛋白基因建立了LAMP 結合CRISPR Cas12a 系統的ASFV 便攜式檢測方法，檢測限可達7 copies/μL，檢測時間只需30 min；反應結束后可在藍光（440～485 nm）下肉眼觀察到熒光，與臨床樣本的qPCR 檢測結果具有較好的一致性。Ceruti 等[23]基于ASFV p72 蛋白編碼基因B646L建立了RPA 檢測方法，該方法只需42 ℃反應15 min，最低檢測限為3.5 copies/μL，與qPCR 具有較好的一致性。為了節約時間和耗材以及方便基層人員和應急情況下的檢測，Wang 等[24]將RPA與側流技術相結合，建立了一種用于ASFV 定點診斷的金納米顆粒試紙條，稱其為側流基因檢測（lateral f low gene assay，LFGA）。LFGA 在反應溫度較低（37～42 ℃）、反應時間較短（30 min）的條件下，能特異性識別ASFV 和豬瘟病毒感染血樣中的ASFV，檢測限可達102copies/μL，與瓊脂糖凝膠電泳結果相當。LFGA 實現了快速RPA 擴增后產物的可視化觀察，整個過程不需要任何昂貴的儀器，使ASFV 在有限的環境中實現了點對點診斷。為了克服傳統診斷方法耗時長、要求高、不直觀等缺點，Fu 等[25]針對p72 蛋白基因建立RPACas12a 熒光檢測法用于ASFV 的定點檢測，其最低檢測限7 copies/μL，20 min 內即可進行可視化檢測。曾宇晨等[26]根據ASFVB646L、EP402R基因和多基因家族成員MGF360/505基因保守序列，設計特異性的ERA 探針和引物，建立了42 ℃等溫條件下檢測ASFV 的ERA 方法，對應基因建立的3種檢測方法分別在16、7 和13 min 內即可得出檢測結果，檢測下限均為102copies/μL，特異性強。用該方法與我國現行ASF 診斷技術標準中的方法對比，結果符合率為100%，從而為流行病學調查和現場檢測提供了一種快速有效的檢測方法。等溫擴增方法具有操作簡單、不需要昂貴的儀器設備、檢測時間短、成本低、攜帶方便、靈敏度高等特點，可在等溫條件下快速進行現場檢測，因而為ASF防控提供了一種快速、直觀的檢測手段。

3 抗原檢測

抗原檢測是針對ASFV 的結構蛋白而建立的一種檢測方法。該方法基于抗原抗體反應的基本原理，通過制備針對特定抗原表位的特異性抗體，在體外與病毒蛋白結合形成免疫復合物，從而對樣品中ASFV 的結構蛋白進行檢測，能夠在發病早期和急性感染的窗口期檢測到病毒。目前，抗原檢測常用的方法有熒光抗體試驗、夾心ELISA 抗原檢測、高敏免疫熒光分析法、免疫層析試紙條等。

3.1 熒光抗體試驗

ASFV 熒光抗體試驗（f luorescent antibody test，FAT）可用于檢測可疑豬組織樣品中的病毒抗原。該方法被OIE 列為ASF 的輔助診斷方法，用于病毒分離和紅細胞吸附試驗的補充試驗，能夠區分ASFV 和其他病毒產生的細胞病變，及對“非紅細胞吸附”ASFV 感染豬進行檢測，但FAT 對熒光素標記的抗原特異性要求較高，非特異性的熒光素染色會造成假陽性結果。此外該方法對亞急性和慢性ASF 檢出率低，僅為40%，但對早期急性ASF 病例檢出率高[27]。該方法操作簡單、快速、特異性強，但對人員要求較高，需要熒光顯微鏡以及必須在相應的生物安全三級及以上實驗室進行，不適用于現場檢測[27]。

3.2 夾心ELISA 抗原檢測

夾心ELISA 是將特異性抗體作為固相包被在96 孔板中，再加入待檢樣品及酶標抗體孵育后顯色，從而可對樣品進行定性或定量的一種方法。我國現行的ASF 檢測標準中是以辣根過氧化物酶標記的ASFV p30 蛋白單抗作包被抗體，對樣品進行檢測。而目前已有的商品試劑盒是西班牙INGEASA 公司的ASFV 抗原檢測ELISA 試劑盒（DAS-ELISA）。Gallardo 等[28]用該試劑盒對277 份臨床樣本進行檢測，與qPCR 相比較檢測的敏感性為77.2%。張麗[27]制備了兩株p54 蛋白單克隆抗體，命名為2E8 和HRP-6D8，基于這兩種單克隆抗體建立了ASFV 雙抗體夾心ELISA 檢測方法。該方法與DAS-ELISA 試劑盒檢測結果符合率為91.8%（134/146）。該方法操作較為簡便、快速、成本較低，對儀器設備要求較低，較于抗體檢測而言，可以更早地檢出ASFV 感染，適用于對ASF的高通量檢測和早期快速篩查，特別是對于早期急性型ASF 的診斷敏感性較高。而對于亞急性型和慢性型ASFV 感染，由于抗原-抗體復合物的存在，該方法的特異性及靈敏性稍低，易出現假陽性結果。因此，目前抗原ELISA 應與OIE 推薦的診斷技術結合使用，而較早開發一種快速、敏感、特異的ASFV 抗原ELISA 檢測方法對ASF 防控極其重要。

3.3 高敏熒光免疫分析法

高敏熒光免疫分析法是一種將獨特的鑭系元素和免疫學反應結合起來，根據標準濃度曲線對待檢樣品濃度進行定量檢測的新型檢測技術。我國現行的ASF 檢測標準是以鑭系元素螯合物為熒光信號與抗原抗體免疫層析技術結合起來檢測ASFV 抗原。Chen 等[29]利用Eu3+-螯合物標記制備的p30 單克隆抗體建立了一種檢測ASFV 的時間分辨熒光免疫分析法（time-resolved f luorescence immunoassay，TRFIA），最低檢測限為0.015 ng/mL，檢測線性范圍為0.24～500.00 ng/mL，室溫下只需45 min 即可得到結果，與農業農村部批準使用的LAMP 同時檢測125 份豬鼻液，兩者結果一致。TRFIA 具有較高的敏感性、特異性和準確性，為養豬業快速篩查ASF 提供了一種新方法。

3.4 膠體金免疫層析試紙條

膠體金免疫層析試驗（colloidal gold-based immunochromatographic assay，GICA）是將膠體金標記后的抗待測物抗體的標記物顆粒固定于玻璃纖維上，同時在硝酸纖維素膜上固定特異性抗體和抗抗體，分別作為檢測帶（test line）和質控帶（control line），當試紙條插入檢測樣品時，抗原與抗體反應導致大量膠體金顆粒的聚集，進而呈現顯色反應[30]。

為滿足基層實驗室或屠宰場、養殖場實驗室對ASFV 的檢測需求，王之瑩[31]等針對ASFV p72蛋白基因設計一對特異性引物進行PCR 擴增，并與膠體金試紙條技術結合，建立了一種低成本檢測ASFV 的側流核酸測定試紙條（lateral f low nucleic acid assay，LFNAA）。該方法能夠在2 h 內肉眼鑒定出結果，與中國動物疫病預防控制中心認可的ASFV 檢測試劑盒的靈敏度相一致，均能達到103copies/uL。鄔旭龍等[32]針對ASFV pK205R 蛋白制備了兔抗多克隆抗體，建立了ASFV 膠體金檢測試紙條，其最佳標記量約為40 μg/mL，T 線捕獲抗原的抗體標記最適質量濃度約為1.5 mg/mL，質控C 線標記最適質量濃度約為2 mg/mL，最小檢測量為30～40 ng/mL。該方法操作簡便，檢測快速，反應條帶清晰可見，且具有較高的檢測特異性，為臨床檢測的推廣和應用提供了科學依據。Zhang等[33]制備了兩株針對ASFV 磷蛋白P30 的單克隆抗體，分別命名為3H7A7 和6H9A10，并基于這2株單克隆抗體建立了用于快速檢測ASFV 的膠體金試紙條，檢出限為2.16 ng，檢測153 份臨床現場樣本（包括血清、血漿、組織和抗凝血處理過的血液），其結果與qPCR 的一致性為95.42%，為基層、現場快速篩選可疑感染豬供了一種方便、快捷、簡單的檢測技術，有利于在現場基層推廣使用。

該方法使用方便，操作簡單，應用范圍廣泛，整個檢測過程不需要特定的儀器設備與試劑，且結果判定非常直觀，因而對基層檢測ASFV 非常適用。但是由于膠體金標記物的不穩定性和靈敏度不高，在判定時只能給出定性或者半定量的結果，因此更快研制出新型標記物的免疫層析試紙用于ASF 基層防控尤為重要。

4 小結

自2018 年ASF 傳入我國已3 年有余。ASFV存活時間長、抵抗力強，基因組龐大、易變異，感染后抗體持續時間長，甚至可以終生攜帶抗體，截至目前仍無商業化疫苗可用，給我國養豬業造成了巨大經濟損失。為了有效防控ASF，前期的快速檢測/監測和豬場生物安全管理尤為重要。OIE 推薦的病原檢測方法包括病毒分離、FAT以及PCR方法。病毒分離和紅細胞吸附耗時較長，且對實驗室要求較高，通常只有被參考實驗室采用；對于病毒核酸檢測，普通PCR 和qPCR 是OIE 推薦的首選診斷方法，其特異性和靈敏度均較高，但操作復雜、成本高；等溫擴增技術操作簡單、成本低、不需要特殊儀器、檢測時間短、成本低、攜帶方便、靈敏度高，最適用于屠宰場、養殖場的現場檢測，但因特異性不高，而靈敏度過高易出現假陽性，需要不斷地更新和改進；微流控芯片法具有樣品消耗少、檢測速度快、操作簡便、便于攜帶等優點，但因檢測成本高和需要特定的設備未得到廣泛使用；抗原檢測技術FAT 對實驗室要求較高，不適合現場檢測；夾心ELISA 和膠體金免疫試紙條快速、操作簡單、檢測成本低，但敏感性和特異性還需改進。

綜上所述，ASF 病原學檢測技術雖很成熟，但各有優缺點，所以應根據實際情況結合使用。此外，近年來市面上有各種檢測試劑盒，但這些試劑盒的敏感性、特異性和準確性，因缺乏大數據無法得到證實，需要按照標準對其進行評估和驗證，以確保其特異性、靈敏度、精確度和穩定性，從而為基層正確選擇試劑盒提供依據。