某品牌鴿新城疫抗體ELISA 檢測試劑盒性能評價

陳詒偉，付小龍，張 毅，艾尼瓦爾·蘇甫爾，丁 潔，蘇戰強

（1.新疆農業大學動物醫學學院，新疆烏魯木齊 830000；2.喀什職業技術學院，新疆喀什 844000）

鴿新城疫是鴿副黏病毒1 型（PPMV-1）引起的以鴿神經癥狀為主要特征的傳染病[1]，主要特征是呼吸困難、下痢、神經紊亂和漿膜出血，其傳播快，病死率為20%～100%，是現階段危害養鴿業的主要疾病之一[2]。該病的治療沒有可用的特效藥，疫苗免疫接種是防制本病最有效方法[3]。及時開展鴿群新城疫抗體檢測，了解鴿場免疫水平，能很好地反映鴿群的抗病能力。目前鴿新城疫抗體檢測，普遍采用血凝及血凝抑制試驗[4]，而酶聯免疫吸附試驗（ELISA）因其操作簡便、檢測量大、敏感性好的優點也被廣泛使用[5]。然而，在生產應用中發現，一些市售ELISA 檢測試劑盒的檢測結果和鴿群的免疫情況不相符[6]。本試驗以血凝及血凝抑制試驗為標準，對某品牌的鴿抗體ELISA 檢測試劑盒檢測的可靠性、準確性進行評價，以反映其在實踐中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及樣本處理

樣本來自新疆喀什地區規?；濔B殖場及鴿養殖合作社。隨機采集喀什市某規?；B殖場鴿血液樣本96 份，巴楚縣某規?；B殖場鴿血液樣本49 份，疏勒縣某養殖合作社鴿血液樣本47 份，共計192 份。肉鴿翅下靜脈采血2～3 mL/只，采集后斜面靜置，待血清析出后，2 000 r/min 離心10 min，用微量移液器取上層血清至EP 管中，放置實驗室冰箱內，-20 ℃保存待檢。

1.2 儀器及相關試劑

96 孔微量板、微量移液器、ZW-A 型微量振蕩器、aidaTD4Z 低速離心機、生理鹽水、自制1%鴿紅細胞懸液[7]。新城疫標準抗原、新城疫陽性/陰性血清，均購自青島立見診斷技術發展中心。某品牌鴿新城疫抗體ELISA 檢測試劑盒（雙抗原夾心法），市場采購。

1.3 試驗方法

1.3.1 血凝及血凝抑制試驗 試驗具體操作及結果判定，參照國家標準《試驗動物血凝抑制試驗》（GB/T 14926.54—2001）[4]及《新城疫診斷技術》（GB/T 16550—2020）[8]。

1.3.2 ELISA法 試驗按照試劑盒說明進行。

1.4 評價指標

1.4.1 敏感性及特異性 敏感性=真陽性數/（真陽性數+假陰性數）×100%；特異性=真陰性數/（真陰性數+假陽性數）×100%[9]。

1.4.2 陽性似然比與陰性似然比 陽性似然比=真陽性率/假陽性率=敏感性/（1-特異性）；陰性似然比=假陰性率/真陽性率=（1-敏感性）/特異性[10]。

1.4.3 符合率及真實性 符合率=（真陰性數+真陽性數）/（真陽性數+真陰性數+假陽性數+假陰性數）×100%[9]。約登指數=（靈敏度+特異性）-1=[真陽性數/（真陽性數+假陰性數）+真陰性數/（假陽性數+真陰性數）]-1[11]。約登指數也稱正確指數，是評價篩查試驗真實性的指標，指數越大，越接近1，說明篩查試驗效果越好，真實性越大。

1.4.4 ROC 曲線 ROC 曲線（受試者特征曲線，又稱感受性曲線），是以假陽性率（1-特異度）為橫坐標，以真陽性率（敏感性）為縱坐標，連接相鄰ROC 曲線工作點形成的光滑曲線?？梢杂行Ы鉀Q數據不平衡問題，并且可以通過比較ROC 曲線的下面積（AUC）來判斷試驗的準確性，AUC值越大，表明準確性越好[12]。

2 結果及分析

2.1 血清樣品檢測

2.1.1 血凝及血凝抑制試驗 192份血清樣品中，檢出陽性（≥4log2）154 份，陽性率為80.2%，陰性（≤3log2）38 份，陰性率19.8%（表1）。

表1 血凝及血凝抑制試驗結果

2.1.2 ELISA法 192 份血清樣品中，檢出陽性（OD ≥臨界值）20 份，陽性率為10.4%，陰性（OD ＜臨界值）172 份，陰性率為89.6%（表2）。

表2 ELISA法檢測結果

2.2 性能評價

以血凝及血凝抑制試驗結果作為“金標準”，對ELISA 檢測結果進行判定，結果發現192 份樣品中，真陽性19 份、真陰性37 份，假陽性1 份、假陰性135 份（圖1）。

2.2.1 敏感性及特異性 ELISA 試劑盒敏感性=19/（19+135）×100%=12.3%；特異性=37/（37+1）×100%=97.4%。對比“金標準”來看，該品牌試劑盒敏感性很低，難以有效反映鴿群新城疫抗體。但特異性高，檢測到的陽性樣品幾乎都有較高抗體水平。

2.2.2 陽性似然比與陰性似然比 計算得知，ELISA 試劑盒的陽性似然比=0.123/（1-0.974）=4.73；陰性似然比=（1-0.123）/0.974=0.90。陽性似然比與陰性似然比取值范圍均為（0，+∞），陽性似然比值越大，檢測方法證實抗體陽性能力越強；陽性似然比值越小，檢測方法排除陰性能力越強[10]。該指標全面反映篩檢試驗的診斷價值，相對穩定。臨床實踐過程中，陽性似然比＞10 或陰性似然比＜0.1，都可以提供令人信服的數據；陽性似然比＞5 或陰性似然比＜0.2，也是有利的診斷證據[13]。結果可以看出，該試劑盒敏感性較低，檢測結果假陰性率較高，導致陽性似然比較低，陰性似然比較高[13]。因此評價該檢測試劑盒抗體陽性檢出能力、抗體陰性排除能力均較低，可能會造成養殖企業對免疫情況的誤判，增加免疫劑量和免疫次數，使養殖企業投入更多的非必要免疫成本。

2.2.3 符合率及真實性 ELISA 試劑盒的符合率=（37+19）/（37+19+1+135）×100%=29.1%；約登指數=[19/（19+135）+37/（1+37）]-1=0.097。數據表明：該試劑盒符合率較低，與國家標準存在較大差異，檢測結果真實性較低。

2.2.4 ROC 曲線 由ROC 曲線結果來看，P=0.01，有統計學意義，曲線下面積（AUG）為0.635，說明該試劑盒針對鴿新城疫抗體檢準確性較低（圖2、表3）。

表3 ELISA 試劑盒結果ROC 曲線相關數值

2.2.5 評價結論 綜上所述，該品牌ELISA 試劑盒的敏感性、真實性、符合率、準確性均較低，證實抗體陽性檢出能力及陰性排除能力較弱，不能為生產實踐提供有效指導。

3 討論

抗體檢測是監測免疫效果好壞的重要手段，不同檢測手段所得結果不同，只有可靠的檢測方法才能指導臨床生產。目前檢測鴿新城疫抗體的方法中，應用最為廣泛的是新城疫檢測國家標準中建議的血凝及血凝抑制試驗，以及操作簡便、敏感性高，且特異性強的ELISA 檢測方法[14-15]。本研究分別用血凝及血凝抑制試驗和ELISA 檢測方法，同時檢測了192 份鴿血清樣本，結果兩者差異很大。鑒于血凝及血凝抑制試驗是新城疫抗體檢測的“金標準”，結合鴿場新城疫疫苗免疫實情，判定所購買的ELISA 試劑盒檢測可靠性存在問題。

ELISA 檢測試劑盒準確性會受到很多因素的影響。研究認為，陽性標準設定會影響試劑盒檢測結果，試劑盒生產廠家通常根據企業實際需求、攻毒試驗結果等自行制定陽性標準，使得檢測結果與血凝抑制試驗國家標準不吻合，并且不同產品的陽性判定標準也存在差異性[6，16]。也有研究[17]表明，ELISA 試劑盒易受熱穩定性影響，在運輸和儲存過程中無法保證合適的溫度，會降低ELISA 試劑盒的敏感性和特異性，降低試劑盒貨架壽命，導致其準確性降低。還有研究[18]認為，ELISA 檢測結果不理想與產品質量有關，部分產品為追求價格優勢，而不重視產品質量，導致其準確性及有效性無法得到保證。除此之外，內外源性干擾物、交叉反應等因素也可能對ELISA 試劑盒準確度造成影響[19-20]。

本次評價的某品牌試劑盒可靠性較差，可能與ELISA 試劑盒標準設定有關。在與廠家技術人員聯系過程中，廠家表示其陽性標準根據攻毒試驗得出，與國家標準存在差異。也可能與試劑盒穩定性有關?？κ驳貐^無本地產鴿新城疫抗體ELISA檢測試劑盒，需從內地發貨，路途較為遙遠，快遞時間長達7～10 d，若試劑盒熱穩定性較差，且不能冷鏈運輸，會影響試劑質量，從而影響試驗結果。當然也不排除試劑盒存在質量問題的可能?？傊?，評價認為該產品準確性較低，不能應用于生產實際。

采購、使用不合格的ELISA 試劑盒，可能會導致嚴重后果。多倫多大學研究人員Prassas等[21]曾報道，因購買不合格ELISA 產品，使研究團隊整整忙碌兩年時間，花費超過50 萬美元研究經費，卻沒有得到試驗結果；阿拉巴馬州研究人員Gutierrez 等[22]也曾因購買不合格ELISA 產品，導致試驗失敗，蒙受巨大經濟損失?？梢娭贫ㄓ行У腅LISA 檢測試劑評價方案在ELISA 試劑的研制和應用中均具有重要的意義。隨著鴿產業在全國各地發展，對免疫抗體檢測的需求也在增加，也有一些快檢產品不斷被生產出來，但其檢測的可靠性不得而知。此次針對鴿專用新城疫抗體ELISA 檢測試劑盒的質量評價方案參照布魯氏菌病、乙肝等試劑盒的評價方案設計，以血凝抑制試驗結果作為金標準，比對了ELISA 檢測結果，通過計算其敏感性、特異性、陽性似然比、陰性似然比、符合性、約登指數、ROC 曲線，系統地體現了該ELISA 檢測產品的性能及特點。這種評價方法，也可為其他類似檢測試劑盒質量評價標準的建立和生產實踐中檢測產品的選擇提供有效參考。