綿羊肺炎支原體云南分離株鑒定及其TU/HSP70 基因特征分析

湯琳波，李富祥，邵慶勇，王金萍，樊月圓，高華峰

（1.云南省畜牧獸醫科學院，云南昆明 650224；2.云南農業大學，云南昆明 662400）

羊傳染性胸膜肺炎主要是由絲狀支原體山羊亞種（Mmc）、綿羊肺炎支原體（Movi）、山羊支原體山羊亞種（Mcc）和山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）等引起的在山羊或綿羊中普遍流行的接觸性傳染病[1-4]。該病在云南省冬春兩季最為常見，以發熱、咳嗽、喘氣、漸進性消瘦、肺間質性肺炎為主要病變特征。羊群感染后發病率較高，病程也較長，因此其對養羊業造成了嚴重危害。

由于羊傳染性胸膜肺炎的病原復雜，存在多種病原體，不同支原體及亞種致病性及毒力也存在較大差異。因此，加強病原監測是控制本病的重要環節。對山羊傳染性胸膜肺炎病原監測表明，Mmc 和Movi 是感染山羊的兩種優勢支原體株，其中Mmc 檢出率較低，但致病性更強，Movi 檢出率較高，但感染后癥狀表現較輕[3]。伴隨著分子生物學和基因工程技術發展，關于羊傳染性胸膜肺炎在分子水平上的研究取得了長足進展。研究[5-7]發現，Movi 16S rRNA 序列相似性較高，不同株同源性可達99.3%～99.9%，因此基于該基因的PCR 快速檢測方法能很好地完成病原檢測[7-9]。目前借助分子生物學技術，對病原檢測的方法已較為完善。但基于血清學方法對本病檢測及免疫評估仍缺乏相應手段?，F有研究[10]表明，Movi 熱休克蛋白（HSP70）及延伸因子（TU）具有較好的抗原性。2020 年冬季，本課題組從云南省昆明市某山羊養殖場分離到一株Movi，在完成形態學及16S rRNA 比對分析的基礎上，系統研究分析了TU和HSP70兩種基因序列特征及抗原特性，以期為了解云南省Movi 病原學特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 2020 年冬季，由于氣候變化波動較大，云南省昆明市某山羊養殖場部分羊群發病。病羊初期表現為精神沉郁、食欲不振、被毛粗亂無光、有黏液性化膿性眼鼻分泌物、呼吸急促，羊群自然發病率為30%左右，但死亡率較低。從不同發病時期采集病羊鼻分泌物、死亡羊肺臟、扁桃體組織及胸腔積液，用于病原分離培養，同時采集康復期羊血清。

1.1.2 主要培養基 支原體瓊脂基礎培養基CM0410B、支原體肉湯基礎培養基CM0403B 及補充培養基SR0059C，均購自賽默飛公司，參照使用說明書配制使用。

1.1.3 主要試劑 原核表達載體pET-28a、大腸桿菌DH5α 菌株、大腸桿菌BL21 菌株，由本實驗室保存；2×PremixTaq、限制性內切酶、DNA連接酶、pMD18-T 載體、質粒提取試劑盒、細菌基因組DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒及DNA Marker 等分子生物學試劑，購自大連寶生物公司；IPTG 及蛋白Marker，購自Sigma 公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG，購自北京索萊寶公司；引物合成及測序，由昆明碩擎生物技術有限公司完成。

1.1.4 樣品DNA 提取 參照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書，提取樣品及純培養物DNA 后于-20 ℃保存備用。

1.2 病羊臨床癥狀及病理剖檢觀察

觀察記錄羊發病過程臨床表現，并對死亡羊只進行常規剖檢。

1.3 支原體分離純化

扁桃體及肺臟組織用含青霉素的雙蒸水清洗后研磨，再加入2 mL 液體篩選培養基增菌，2 000 r/min 離心5 min；取上清液接種至固體培養基，將固體培養基置于37 ℃ 5% CO2培養箱中繼續培養5 d；挑取單菌落接種于液體培養基上進行培養，得到純培養物。

1.4 支原體樣品16S rRNA 檢測及鑒定

使用細菌基因組提取試劑盒分別提取分泌物、組織樣品及分離純培養物的基因組DNA，根據參考文獻[5]合成Movi 及Mmc 16S rRNA 檢測引物（表1）。用上述引物對提取的基因組DNA 同時進行PCR 擴增，反應體系（25.0 μL）：PremixTaq12.5 μL，上下游引物分別為0.5 μL，模板2.0 μL，最后用滅菌蒸餾水補足至25.0 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共進行35 個循環；72 ℃延伸7 min。PCR 反應產物經膠回收純化后，送昆明碩擎生物技術有限公司測序，將所得序列與GenBank中16S rRNA 序列進行比對驗證。

表1 Movi 及Mmc 16S rRNA 擴增引物信息

1.5 Movi HSP70 及TU 基因PCR 鑒定

分別設計2 對擴增全長HSP70及TU基因序列的特異性引物（表2）。以病原分離培養中純培養的支原體基因組DNA 為模板，進行PCR 擴增。反應體系（25.0 μL）：PremixTaq12.5 μL，上下游引物分別為1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，最后用滅菌蒸餾水補足至25.0 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共進行35 個循環；72 ℃延伸7 min。PCR 反應產物經膠回收純化后，連接克隆載體pMD18-T，完成陽性鑒定后送昆明碩擎生物技術有限公司測序。將所得序列與GenBank 中參考序列進行比對，并采用鄰接法（Neighbor Joining method，NJ法）構建系統發育樹。

表2 HSP70 及TU 基因擴增引物信息

1.6 HSP70 及TU 基因生物信息學分析

將克隆所得HSP70及TU基因測序驗證結果，與GenBank 收錄的支原體序列完成比對，利用MEGAX 軟件構建NJ 進化樹，分析Movi 分離株與其他株的親源關系，并利用DNAstar 軟件分析不同支原體序列核苷酸的同源性。

1.7 表達載體構建及HSP70 及TU 蛋白誘導表達

對測序正確的克隆載體和表達質粒pET-28a分別進行NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切，目的片段和載體膠回收后用T4 DNA 連接酶置于16 ℃過夜連接；將連接產物轉化至DH5α 感受態細胞，克隆經PCR測序驗證后提取質粒轉化BL21 感受態細胞；將陽性單克隆接種LB 培養基，在OD600達到約0.6 時加入1 mol/L IPTG 誘導6 h，以12 000 r/min 離心5 min 收集表達菌體沉淀及上清。

1.8 蛋白染色及Western blot 分析

取40 μL 表達上清及經超聲波裂解后的菌體，加入10 μL 5×SDS-PAGE loading Buffer 煮沸10 min并置于冰上，12 000 r/min 短暫離心后，取10 μL樣品進行SDS-PAGE 電泳；棄去濃縮膠，將分離膠放入考馬斯亮蘭染色液中過夜染色，煮沸脫色后完成凝膠成像。將完成電泳的樣品同時轉移到硝酸纖維素膜上，經5%脫脂奶封閉后加入康復期綿羊血清4 ℃孵育過夜，用PBST 洗凈，加入按1:2 000 比例稀釋后兔抗羊過氧化物酶標記IgG，孵育1 h 后PBST 清洗，加入顯色底物完成顯色。

2 結果

2.1 臨床癥狀

該場羊只病例呈散發性，表現為冬季溫差較大時易發病，病程較長，發病率較高，但死亡率較低，以咳嗽、精神沉郁、食欲不振、被毛粗亂、眼結膜潮紅、有黏液性化膿性眼鼻分泌物為主要癥狀。隨著病情加重，全群采食量下降，羊群自然發病率約為30%。治療后死亡病例少。剖檢病死羊發現，呼吸道及肺部出現典型病理變化，剖檢可見扁桃體腫大、化膿并充血，病程加長后鼻甲骨變形為典型癥狀，肺局部發生肉變，胸腔有少許紅色積液及黃色分泌物（圖1）。

2.2 支原體分離

將純化培養后的分離株接種至固體培養基，在37 ℃ 5% CO2培養箱中培養3～5 d 后，可觀察到灰白色針尖狀大小菌落。挑取針尖狀培養物完成純培養，低倍顯微鏡下觀察菌落形態，菌落呈“煎蛋樣”形態（圖2）。

2.3 16S rRNA PCR 鑒定及HSP70、TU 基因克隆

分離株純化后，將2 個單菌落分別接種于液體培養基進行增菌培養；提取支原體基因組DNA，經兩對16S rRNA 通用引物擴增后獲得與預期相符的條帶，其大小為563 bp，二重PCR 未見Mmc 陽性擴增（圖3-A）；擴增條帶樣品測序后，經BLAST 分析比對確定為Movi，并將其命名為YN-2020 株。完成陽性鑒定的單菌落經HSP70及TU基因全長引物擴增，結果顯示，TU基因擴增大小為1 209 bp，HSP70基因擴增大小為1 818 bp，均與預期大小相符（圖3-B、C）。

2.4 YN-2020 分離株遺傳進化分析

Movi 分離株YN-2020TU基因全長經PCR 擴增后，產物與克隆載體pMD18-T 連接轉化，涂板后經PCR 完成陽性克隆篩選，測序驗證確定序列信息。根據TU基因序列與GenBank 初步比對結果，從中選取具有代表性的14 株支原體序列構建遺傳進化樹，并完成核苷酸序列比對。遺傳進化分析結果顯示：Movi 分離株YN-2020TU基因與Movi MoGH3-3 株親緣關系較近，與Movi 標準株Y98 親緣關系較遠；在不同支原體種間，YN-2020TU基因與牛殊異支原體（Dispar）親緣關系較近，與禽滑液囊支原體（Synoviae）親緣關系較遠（圖4-A）。核苷酸序列比對結果顯示，其與Movi MoGH3-3 株同源性最高（98.2%），與發酵支原體（Fermentans）PG18 株同源性最低（72.8%）。

Movi 分離株YN-2020HSP70基因全長經PCR 擴增后，產物與克隆載體pMD18-T 連接轉化，涂板后經PCR 完成陽性克隆篩選，測序驗證確定序列信息。根據HSP70基因序列與GenBank初步比對結果，從中選取具有代表性的15 株支原體序列構建遺傳進化樹，并完成核苷酸序列比對。遺傳進化分析結果顯示：Movi YN-2020 分離株HSP70基因與Movi 117 株親緣關系較近，與Movi NCTC10151 親緣關系較遠；在不同支原體種間，YN-2020HSP70基因與Dispar親緣關系較近，與豬鼻支原體（Hyorhinis）親緣關系較遠（圖4-B）。核苷酸序列比對結果顯示，其與Movi 117 株核苷酸同源性最高（99.4%），與HyorhinisHub-1 株同源性最低（80.1%）。

2.5 YN-2020 分離株TU 及HSP70 蛋白誘導及表達

對含有目的基因的重組質粒和空表達載體pET-28a 雙酶切后，以T4 DNA 連接酶連接，將重組表達載體轉入大腸桿菌BL21（DE3）中完成表達克隆載體構建，并將其分別命名為pET28a-rTU及pET28a-rHSP70。兩種重組菌落分別于20 ℃培養16 h 及37 ℃培養6 h（兩種蛋白均使用兩種溫度條件進行誘導表達），誘導后分別收集菌體沉淀及上清，菌體經超聲破碎后，取樣進行SDS-PAGE電泳及免疫印跡檢測。染色結果顯示：表達載體pET28a-rTU 在20 ℃培養16 h 及37 ℃培養6 h 均能較高量表達TU 蛋白，誘導后TU 蛋白在上清中表達量低，在菌體沉淀中表達量高，重組蛋白大小約48.0 kDa，與預期大小一致（圖5-A、B）；表達載體pET28a-rHSP70 在20 ℃培養16 h 及37 ℃培養6 h 均能表達HSP70 蛋白，但在20 ℃誘導培養16 h 獲得的重組蛋白表達量較高，且在上清及菌體沉淀中均有表達，重組蛋白大小約68.0 kDa，與預期大小一致（圖6-A、B）。

3 討論

傳染性胸膜肺炎是由不同支原體引起的一類重要山羊和綿羊傳染病。該病廣泛分布于世界各主要山羊及綿羊養殖地區，尤其是亞洲和非洲國家。病原學和血清流行病學研究[1-3]表明，不同國家和地區羊群中流行的羊群感染支原體優勢菌株存在較大差異。近年來，由支原體感染引起的傳染性胸膜肺炎在我國呈現增多趨勢，不同地區流行的羊傳染性胸膜肺炎主要由Movi 和Mmc 引起，兩種支原體的混合感染給疾病防控帶來了困難[1-5]。云南省病原監測表明，這兩種支原體是最常見的優勢菌種。流行病學監測發現：Mmc 檢出率低但致死率高；Movi 檢出率較高，部分未引起發病的羊場也能通過PCR 檢出，一旦有應激因素如氣候激烈變化或發生基礎性疾病，就可能引發局部流行。單純由Movi 引起的羊群死亡率較低，多數病例伴隨細菌（如巴氏桿菌及鏈球菌）繼發感染，給本病防治增加了困難。

Movi 在云南省羊群中較高的陽性率以及帶來的防治成本增加，制約了肉羊養殖效益提高，因此需要強化病原學研究。本研究中，結合云南省部分羊場支原體病原監測工作，采集病料完成了病理剖檢及病原檢測。病理剖檢表明，本次羊場羊只呼吸道感染疾病由Movi 引起，主要癥狀表現為扁桃體腫大及慢性肺炎。在上述工作的基礎上，完成了病原分離鑒定，并對YN-2020 分離株部分抗原基因進行了基因特征及蛋白表達研究。遺傳進化樹分析表明，分離株YN-2020TU及HSP70基因均存在一定程度變異，在與國內外流行株比較中，TU基因與Movi MoGH3-3株核苷酸同源性最高（98.2%），與FermentansPG18 株同源性最低（72.8%）。HSP70基因則與Movi 117 株核苷酸同源性最高（99.4%），與HyorhinisHub-1 株核苷酸同源性最低（80.1%）。YN-2020 分離株與其他代表株相比，核苷酸同源性較高，兩種基因均較為保守，其中HSP70基因保守性高于TU基因。此外，兩種蛋白抗原性分析表明，兩種蛋白在Western blot 檢測中均與康復期綿羊血清有反應性，提示表達蛋白具有良好的免疫原性。對兩種蛋白的結構與功能仍需加深研究，以期指導未來生產實踐。