濃戊二醛防凍消毒劑的防凍及消殺效果

龐學敏，謝書宇，盧 迪，齊六衛，趙寶凱，楊作豐，劉 俊，高志峰，魏園園，董 娜

（1.遼寧省農業發展服務中心，遼寧沈陽 110015；2.華中農業大學動物醫學院，湖北武漢 430070；3.沈陽偉嘉牧業技術有限公司，遼寧沈陽 110027；4.沈陽市農業綜合行政執法隊，遼寧沈陽 110000）

2018 年我國首發非洲豬瘟疫情[1]。非洲豬瘟疫情對我國生豬飼養以及屠宰、運輸、獸藥、飼料等相關產業都造成了極大沖擊，造成的損失不可估量。非洲豬瘟是我國的一類動物疫病，發病率、病死率可高達100%[2]。針對非洲豬瘟，目前仍沒有有效的疫苗可用[3]，因此隔離傳染源、切斷傳播途徑是最有效的防控措施[4]。其中，消毒是最直接、有效、簡單的控制手段之一，做好疫點、疫區消毒工作，可以有效抑制疫情擴散[5]。

濃戊二醛是新一代醛類消毒劑[6]。它不僅克服了甲醛消毒劑的諸多缺點，也具有很強的廣譜殺菌能力，是當前醛類消毒劑中應用較廣的一種消毒劑，在農業農村部公布的《非洲豬瘟疫情應急實施方案》（第五版）中被列為推薦的消毒劑種類，主要應用于車輛等運輸工具、畜舍建筑物、圍欄、木質結構物、水泥表面、地面等的消毒，是生豬飼養場常用的開放環境消毒藥。

東北地區冬季溫度常達-20 ℃以下，室外噴灑濃戊二醛消毒劑很快就會結成冰膜，直接限制了消毒液顆粒的運動，既起不到消毒作用，也會對路面行車安全造成隱患，對疫點、疫區的疫病防控以及省界動物衛生監督檢查站、飼養場戶的冬季日常消毒造成極大困擾。為解決東北地區冬季消毒問題，向濃戊二醛消毒劑中添加不同量的防凍劑，并開展防凍及消殺效果試驗，篩選最佳防凍劑添加量。

1 材料與方法

1.1 材料

防凍劑：主要成分為乙二醇[7]，由沈陽偉嘉生物技術有限公司提供；消毒劑：20%的濃戊二醛成品（批號2020120101），由沈陽偉嘉生物技術有限公司提供；非洲豬瘟病毒：以高致病性Pig/HLJ/2018 毒株為骨架，構建攜帶GFP 標簽的感染性克隆毒株，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（國家非洲豬瘟專業實驗室）鑒定和保存；標準菌：金黃色葡萄球菌（G+）與大腸桿菌（G-），購自廣州市辰飛生物科技有限公司；營養瓊脂：沈陽偉嘉生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 防凍性能測試標準 參照國家衛生健康委辦公廳印發的《低溫消毒劑衛生安全評價技術要求》。

1.2.2 防凍性能測試試驗 將防凍劑分別以2、3、4 mL 的添加量加入到100 mL 濃戊二醛成品中（對應體積分數分別為2%、3%、4%），充分溶解，在-10 ℃條件下放置24 h，記錄防凍情況；將防凍劑分別以8、10、12、14 mL 的添加量加入到100 mL 濃戊二醛成品中（對應體積分數分別為8%、10%、12%、14%），充分溶解，在-20 ℃條件下放置24 h，記錄防凍情況。將不添加防凍劑的濃戊二醛成品作為空白對照組，在-20 ℃條件下放置24 h，記錄上凍情況[8]。

1.2.3 抑菌試驗 依據《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》（GB/T 38502—2020），用斜面培養基分別培養金黃色葡萄球菌與大腸桿菌[9]，培養好后冷藏備用。配制營養瓊脂，滅菌備用。在玻璃平皿中加入20 mL 營養瓊脂，凝固后用生理鹽水沖洗斜面培養基，取3%的菌液加入涼至45 ℃以下的營養瓊脂中，搖勻；取5 mL 加入平皿中，凝固后擺放4 個牛津杯，統一加樣量為200 μL（孔徑6 mm），分別加入生理鹽水（孔1）以及不加防凍劑消毒劑（孔2）、10%防凍消毒劑（孔3）和12%防凍消毒劑（孔4）的100 倍稀釋液，蓋上陶瓷蓋37 ℃恒溫培養12～16 h 后觀察抑菌圈大小。

1.2.4 體外殺滅非洲豬瘟病毒試驗 委托中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（國家非洲豬瘟專業實驗室）開展試驗。依據《非洲豬瘟診斷技術》（GB/T 18648—2020），將12%的防凍消毒劑與病毒液等體積均勻混合，在-20～20 ℃的不同溫度條件下，每10 ℃設為一檔，分別作用10、30、60 min，加入中和劑室溫作用10 min；分別以5%、10%、20%的體積分數用水稀釋防凍消毒劑，然后接種于已長滿單層 PAMs 細胞（豬肺泡巨噬細胞）培養板中，每個稀釋度重復4 孔，同時分別設置中和劑對照組、陽性對照組和陰性對照組；放置于37 ℃5% CO2溫箱中培養，每24 h 觀察細胞狀態及病毒復制產生熒光情況[10]，96 h 后統計試驗結果。3 種稀釋度（體積分數5%、10%、20%）的防凍消毒劑滅活病毒結果判定標準：以陽性對照組細胞90%以上出現明顯熒光信號，陰性對照組孔內無熒光信號為前提，若試驗組無明顯熒光信號，證明非洲豬瘟病毒被完全殺滅，若試驗組孔內出現明顯熒光信號，證明非洲豬瘟病毒未被防凍消毒劑完全滅活。

1.2.5 消毒劑含量檢測 依據《中國獸藥典》（2020年）質量標準檢測。檢測樣品：添加防凍劑的濃戊二醛消毒液（體積分數12%）和添加水的濃戊二醛消毒液（體積分數12%）。檢測時間：配制成品前以及配制成品后24、48 h。檢測試劑：三乙醇胺溶液、鹽酸羥胺、純化水、異丙醇、溴酚藍乙醇、硫酸滴定液。含量檢測方法[11]：取本品1 mL（相當于戊二醛約0.20 g），精密稱定，加入體積分數6.5%的三乙醇胺溶液20 mL、鹽酸羥胺中性溶液（取鹽酸羥胺17.50 g，加水75 mL 溶解，用異丙醇稀釋至500 mL，搖勻，加體積分數為0.04%的溴酚藍乙醇溶液15 mL，用體積分數為6.5%的三乙醇胺溶液滴定至溶液顯藍綠色）25 mL，搖勻，放置1 h；用硫酸滴定液（0.25 mol/L）滴定至溶液顯藍綠色，并將滴定結果用空白試驗校正。每1 mL硫酸滴定液（0.25 mol/L）相當于25.03 mg 戊二醛。戊二醛有效含量=（空白滴定體積-樣品滴定體積）×滴定液F 值×25.03/（樣品稱樣量× 規格）/1 000×100%；F 值=實際濃度/名義濃度。

2 試驗結果

2.1 防凍效果

不同體積分數的防凍消毒劑在-10℃、-20 ℃條件下，24 h 內防凍性均較好，沒有出現凍結現象（表1）。

表1 不同體積分數防凍消毒劑在不同溫度下的凍結情況

2.2 抑菌效果

各消毒劑100 倍稀釋后，大腸桿菌及金黃色葡萄球菌培養基的抑菌圈均可達到標準要求（＞15 mm），對金黃色葡萄球菌較為敏感，其中添加防凍劑的消毒液抑菌圈平均大于不加防凍劑的消毒液1 mm 左右（表2）。

表2 消毒劑抑菌圈試驗結果 單位：mm

2.3 殺滅非洲豬瘟病毒效果

5%稀釋的防凍消毒劑在20 ℃條件下作用10 min、10 ℃條件下作用30 min、0 ℃條件下作用60 min 均能完全滅活非洲豬瘟病毒，10%稀釋的防凍消毒劑在-10 ℃條件下作用30 min 能完全滅活非洲豬瘟病毒，20%稀釋的防凍消毒劑在-20 ℃條件下作用30 min 能完全滅活非洲豬瘟病毒（表3）。

表3 不同稀釋度防凍消毒劑與非洲豬瘟病毒作用后熒光觀察結果

2.4 有效含量

經硫酸滴定，體積分數12%的防凍消毒劑首次檢定結果與24、48 h 后的檢定結果標準差為±0.04，有效含量（能夠抑菌的最低含量）分別為96.7%、96.2%和95.6%（表4），說明戊二醛有效含量比較穩定，在2020 年獸藥典規定的標準范圍內（95%～100%）。

表4 體積分數12%防凍消毒液的有效含量檢測結果

3 討論

按照國家衛生健康委辦公廳印發的《低溫消毒劑衛生安全評價技術要求》，在低溫消毒劑說明書規定的最低適用溫度下，測試該低溫消毒劑是否能保持液體狀態。取5 mL 低溫消毒劑（應用液）放置于相應低溫下過夜（＞8 h），觀察并記錄其性狀。該低溫消毒劑保持液體狀態，無析出、無結晶，則判定為合格。本試驗證明，-10 ℃的環境下，在100 mL 濃戊二醛消毒劑中添加2 mL 防凍劑就可以起到很好的防凍效果，-20 ℃的環境下，在100 mL濃戊二醛消毒劑中添加8 mL 防凍劑也可以起到很好的防凍效果，可以有效解決冬季噴灑消毒藥瞬間結冰的窘境和難題。有試驗證明，乙二醇作為防凍劑在低溫情況下的消毒效果最好[12]。本研究參考衛生健康委消毒技術規范進行低溫冷凍試驗，試驗設計更合理、更標準化。

通過抑菌試驗發現，加入防凍劑的濃戊二醛消毒液抑菌效果非但沒有降低反而略有提升。這是因為防凍劑的加入，增加了消毒液的流動性，降低了分子擴散阻力，加快了消毒液擴散速率，使其有效工作濃度得到保證甚至提升；而高濃度金屬離子和陽離子表面活性劑具有高壓滲透作用，可非特異性造成病毒、細菌蛋白變性沉淀，增強其通透性，使其破裂死亡，從而使消毒劑分子更易進入，致使消毒效果有效提升。

經過硫酸滴定試驗發現，防凍劑溶解后呈現pH 中性，理化性質穩定，無腐蝕性，不會與各類酸性或堿性消毒劑發生化學反應，抗有機物能力強，受有機物以及溫度影響小[13]，混合后長時間放置也不會降低消毒液中有效成分含量，可連續使用24 h。

經體外病毒殺滅試驗證明，5%、10%、20%稀釋的防凍濃戊二醛消毒液，在設定溫度下都對非洲豬瘟病毒有很強的殺滅作用。濃戊二醛對非洲豬瘟病毒的殺滅原理為，消毒劑在低溫狀態下與病原蛋白質結合，使其發生變性，破壞其生物膜結構，從而抑制轉運機制，破壞蛋白質-DNA交聯等反應?；瘜W消毒劑中戊二醛具有很強的細胞毒性[14]，結合防凍劑中的高濃度金屬離子和陽離子表面活性劑的高壓滲透作用，可以導致非特異性病毒蛋白變性沉淀，因而提升了戊二醛分子深入病毒、殺滅病毒的能力。因此，在東北地區氣溫較低或高污染條件下，加入防凍劑的濃戊二醛消毒液依然具有對非洲豬瘟病毒很高的殺滅能力[15]。

冬天東北地區氣溫比較低，常規消毒劑在低溫狀態下容易結冰，消毒效果大打折扣，不能夠有效殺滅環境中的病原微生物，尤其是在非洲豬瘟病毒長期存在的大背景下，因氣溫低而導致環境消殺不徹底，感染病毒的概率大幅增加。而以乙二醇為主要成分的防凍劑經過試驗研究發現，防凍效果比較好。乙二醇沸點高、冰點低，是國內外較為常用的穩定劑。配合使用濃戊二醛消毒劑能夠殺滅細菌和病毒，尤其是能夠殺滅非洲豬瘟病毒，從而為養豬業生物安全及環境消毒保駕護航。本研究結果表明，隨著濃度的提升，加入防凍劑的濃戊二醛防凍效果也隨著提升，且具有很好的貯存穩定性，能夠有效滿足北方冬季殺滅非洲豬瘟病毒的需求。