龍生蛭膠囊中“桃仁-紅花-川芎”藥組治療腦卒中網絡藥理學研究*

許海燕，王 珊，彭修娟，陳衍斌，侯敏娜，劉艷紅，逯 莉，劉 峰，△

（1.陜西國際商貿學院，陜西 咸陽712046；2.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075）

腦卒中具有發病率高、死亡率高、致殘率高、復發率高等特點，是導致人類死亡的第二類原因，與缺血性心臟病、惡性腫瘤構成多數國家的三大致死疾?。??2］。龍生蛭膠囊由黃芪、水蛭、桃仁、紅花、川芎等12味中藥材組方，具有補氣活血、逐瘀通絡功效，臨床用于治療氣虛血瘀型中風［3］。方中桃仁味苦、甘，性平，活血化瘀，潤腸通便［4］；紅花味辛，性溫，活血通經，祛瘀止痛［5］；川芎味辛，性溫，活血行氣，祛風止痛［6］。桃仁破血力強，紅花行血力盛，川芎相須為用，共為臣藥行氣化瘀，三藥配伍，共奏活血破瘀之功，具有活血而不傷血、補血而不留瘀的特點，可祛瘀生新［7］。本研究中基于中醫藥整合藥理學研究平臺V2.0（TCMIP V2.0）［8］預測了龍生蛭膠囊中臣藥桃仁?紅花?川芎藥組治療腦卒中的藥效物質基礎和作用機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥組化學成分來源

在TCMIP V2.0“中藥材數據庫”項下分別以“桃仁”“紅花”“川芎”為關鍵詞進行檢索，收集其化學成分，建立“桃仁?紅花?川芎”藥組化學成分數據庫。

1.2 藥組候選靶標來源

在TCMIP V2.0“疾病數據庫”項下以“Stroke”為關鍵詞進行檢索，獲得與腦卒中相關的靶點。在“中藥（含方劑）靶標預測及功能分析”中，依次添加“桃仁”“紅花”“川芎”，對“桃仁?紅花?川芎”藥組化學成分庫中成分的靶標進行預測，選擇“相似性分數≥0.8”的成分預測靶標，作為候選靶標。TCMIP V2.0采用二維結構（.mol或.sdf）進行相似性比對，以Tanimoto系數定義的相似度計量方法進行相似性評分，并與美國食品藥物管理局（FDA）上市藥品的化學結構進行比對［9］。

1.3 蛋白互作網絡（PPI）

TCMIP V2.0鑲 嵌 了HAPPI，Reactome，molecular interaction database（MINT），online predicted human inter?action database（OPHID），database of interacting proteins（DIP）等數據庫中的PPI數據，可直接獲得“桃仁?紅花?川芎”藥組的潛在靶標與腦卒中疾病靶標間的PPI［10］。

1.4 中醫藥關聯網絡構建與關鍵網絡靶標基因功能挖掘分析

在TCMIP V2.0“中醫藥關聯網絡挖掘”項下建立“桃仁?紅花?川芎”藥組作用的潛在靶標與腦卒中疾病靶標間的PPI，通過計算網絡節點連接度、節點介度和節點緊密度，篩選核心節點基因，作為“桃仁?紅花?川芎”藥組治療腦卒中的關鍵靶標網絡。根據中藥、化學成分、核心靶標、通路、疾病間的關聯性，構建中藥多維關聯網絡，篩選“桃仁?紅花?川芎”藥組關鍵網絡靶標基因顯著參與的生物學反應、所行使分子功能及其所在細胞內定位?；贒rugbank，onlinemendelian inheritance in man（OMIM），human phenotype ontology（HPO），gene ontology（GO），therapeutic target database（TTD）及基因相關性數據庫（DisGeNET）等數據庫對“桃仁?紅花?川芎”藥組的預測靶標進行基因功能分析和通路富集分析，利用Reactome數據庫的Pathway信息，篩選“桃仁?紅花?川芎”藥組關鍵網絡靶標基因顯著參與的分子通路；利用ETCM數據庫的疾病和表型數據庫，篩選“桃仁?紅花?川芎”藥組關鍵網絡靶標基因顯著相關的疾病和表型。最終構建“中藥?活性成分?關鍵核心靶標?通路”多層次網絡關聯圖［11?12］。

1.5 主要活性物質與靶點的分子對接

采用Sybyl?X7.3軟件中的Surflex?Dock程序，將“桃仁?紅花?川芎”藥組主要活性物質與細胞外信號調節蛋白激酶2（ERK2）、Janus激酶2（JNK2）進行對接，驗證此藥組治療腦卒中的藥效物質基礎。

2 結果

2.1 靶點預測結果

靶標預測及功能分析結果共得到化學成分121種，包括桃仁3種，紅花46種，川芎72種，主要為有機酸、甾醇類、黃酮類、糖苷類、揮發油類、生物堿類、酯類等。為保證靶標預測結果的可信度，設定桃仁、紅花、川芎中化學成分與FDA上市藥物間的相似性分數≥0.8，得到三者的靶標數目分別為90，426，358個。其中，上述3種藥材共有靶標14個，包括一氧化氮合酶（NOS）及CSNK2A1，FabZ，NQO2，NR1I2，AKT1，NCOA1，NCOA2，ESR1，ESR2，GLTP，CBR1，SHBG，AHR。

基因功能分析和通路富集分析結果顯示，候選靶標基因功能涉及氧化還原過程，離子傳輸、類固醇激素介導的信號通路、脂質代謝過程，細胞內受體信號通路、神經系統的過程，心肌細胞動作電位參與心肌收縮、類固醇代謝過程，化學突觸傳遞、鈣離子傳輸與導入等生物學過程。中藥候選靶標通路富集分析結果顯示，涉及通路有核受體轉錄途徑、氨基丁酸（GABA）受體激活、葉酸代謝、膽汁酸和鹽的循環利用、胰島素分泌調節、突觸前去極化和鈣通道開放、外源性物質等通路。

2.2 核心靶標網絡分析

共得到62個與腦卒中及藥物相關核心網絡靶標，其中27個靶標與藥物相關，35個靶標與疾病相關。利用PPI構建核心靶標網絡圖（見圖1），平臺設定同時滿足大于節點連接度、節點介度、節點緊密度的中位數為卡值。得到關鍵核心靶標25個，包括HSP90AA1，AR，AKT1，CALM1，NFKB1，ESR1等；已知疾病靶標11個，包括NR3C1，LIMK1，VHL，JAK2，HIF1A，APP，SMAD4，GTF2I，GTF2IRD1，FLNA，NOTCH3；藥物與疾病共有靶標2個，包括NR3C1和APP。閆宇翔等［13］從基因整體層面研究發現，NR3C1與心血管疾病危險因素間存在相關性。APP致病變體或重復會導致腦淀粉樣血管病的發生，引發原發性非創傷性腦出血。HSP90AA1與抑郁癥有關［14］，可通過調節HSP90AA1的表達水平來抑制腦卒中后抑郁。AKT1能介導心血管疾病，促進血管內皮生長因子（VEGF）分泌，并介導內皮細胞一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化過程［15］。因此，AKT1可能在許多心血管疾病的發病過程中發揮重要作用。

圖1 核心靶標網絡Fig.1 Network of key targets

2.3 藥組治療腦卒中基因功能及通路信息分析

“桃仁?紅花?川芎”藥組治療腦卒中的靶標與疾病靶標基因功能見表1。通過關鍵靶標功能信息可以推測，“桃仁?紅花?川芎”藥組主要通過調節NOS活性的正向調控、一氧化氮（NO）生物合成過程的正向調控、RNA聚合酶Ⅱ對轉錄的正向調控、細胞內受體信號通路、凋亡過程、信號轉導和基因表達的調控治療腦卒中。NOS可調節NO的生成，而NO是腦血管系統中重要的保護因子［16］，在缺血再灌注損傷過程中起重要作用［17］。

表1 “桃仁-紅花-川芎”藥組治療腦卒中的靶標與疾病靶標基因功能列表Tab.1 List of targets and disease target gene functions of″Persicae Semen-Carthami Flos-Chuanxiong Rhizoma″drug group in the treatment of stroke

“桃仁?紅花?川芎”藥組治療腦卒中的分子通路（見表2）主要涉及核受體轉錄途徑、四氫生物蝶呤（BH4）的合成回收和調控、內皮型eNOS激活、細胞內受體的SUMO化、血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）介導的血管通透性等條目。如通過BH4的合成、回收及調控，增加eNOS的活性，抑制缺血再灌注引起的損傷［18］。缺血性腦損傷的發生與SUMO化有關［19?20］；VEGFR?2可調控血管內皮細胞的增殖、遷移、存活和通透性，促進腦組織缺血區域再灌注［21］。

表2 “桃仁-紅花-川芎”藥組治療腦卒中的分子通路列表Tab.2 List of molecular pathways of″Persicae Semen-Carthami Flos-Chuanxiong Rhizoma″drug group in the treatment of stroke

上述靶標功能和分子通路多數與神經系統、循環系統、內分泌系統、免疫系統有關?，F代醫學研究發現，神經?內分泌?免疫網絡系統調節功能的表達異常，導致神經系統、內分泌系統、免疫系統功能異常［22］，從而導致腦卒中發生。

2.4 網絡可視化圖分析

運用整合藥理學平臺獲得了“桃仁?紅花?川芎”藥組治療腦卒中的核心靶標，推測“桃仁?紅花?川芎”藥組可能通過作用于藥物與疾病共有靶標而發揮對腦卒中的干預作用，進而發揮藥效，并利用核心靶標及其與中藥成分和疾病間的關系繪制“中藥?活性成分?關鍵核心靶標?通路”網絡可視化圖（見圖2）?？梢?，“桃仁?紅花?川芎”藥組中可作用于腦卒中的活性成分共有19種，主要包括生物堿類、揮發油類、黃酮類、有機酸類等，包括桃仁中的兒茶素，川芎中的川芎嗪、阿魏酸、香草醛、甾醇、川芎萜等，紅花中的紅花素、新紅花苷、亞麻酸、亞油酸等。參考文獻［23］，在腦卒中急性期治療的中醫用藥規律中，桃仁、紅花、川芎用藥頻次排在前10位，在腦卒中急性期及恢復期常用“紅花?川芎”藥對。證實該藥組治療腦卒中的可靠性及龍生蛭膠囊組方的合理性?；钚猿煞值难芯匡@示，“桃仁?紅花?川芎”藥組中的兒茶素可通過抑制白細胞的生成來預防血管炎癥，也可抑制血小板黏附及血栓形成，擴張血管［24?25］。川芎嗪通過調節凝血、纖溶系統，調控血小板活化、神經活性配體?受體相互作用等信號通路發揮治療缺血性腦卒中的作用［26］；川芎嗪、阿魏酸能保護腦卒中缺血后的急性損傷［27］。紅花素可通過抑制H2O2誘導的細胞凋亡通路，減少血小板聚集和黏附，發揮防治心血管疾病的作用［28］；何新康等［29］給予腦缺血再灌注模型大鼠腹腔注射不同劑量紅花素，結果顯示，紅花素對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。亞麻酸可通過增加缺血區局部的血流量，減輕腦組織缺血壞死的程度，提高腦缺血后的存活率［23，30］。

圖2 “中藥-活性成分-關鍵核心靶標-通路”多維關聯網絡Fig.2 Multi-dimensional network of″traditional Chinese medicine-active ingredients-key targets-pathways″

2.5 可能有效成分及調控靶點

從Protein Data Bank（PDB）［31］數據庫中下載ERK2和JNK2蛋白晶體結構，分別提取2個靶點蛋白晶體結構的配體，暴露活性位點及除結晶水、加氫和除側鏈的殘基后；采用AMBER7 FF99力場能量優化；使用Surflex?Dock程序對接分子［32］，與篩選得到的“桃仁?紅花?川芎”藥組中主要活性成分進行對接，得到化合物與核心靶點對接后的均方根偏差值（RMSD）。當RMSD≤2.0?時［33］，說明該對接方法能較好地重現出配體受體原來的結合模式，驗證了對接參數設置的合理性。主要活性成分與靶蛋白的對接結果見表3?？芍?，“桃仁?紅花?川芎”藥組中主要活性成分兒茶素、川芎嗪、阿魏酸、紅花素、亞麻酸與ERK2和JNK2均對接成功，推測“桃仁?紅花?川芎”藥組確有治療腦卒中的作用。對其活性成分進行文獻驗證，發現預測出的活性分子，如兒茶素［24?25］、川芎嗪［26?27］、阿魏酸［27］、紅花素［28?29］、亞麻酸［23，30］等活性分子確屬治療腦卒中的有效物質，驗證了本研究方法的合理性與可靠性。

表3 主要活性成分與靶蛋白對接結果Tab.3 Docking results of main active ingredients and target proteins

3 討論

“桃仁?紅花?川芎”作為龍生蛭膠囊中的活血破瘀藥組，治療腦卒中療效顯著［34］。本研究中共預測得到活性成分19個，核心網絡靶標62個，其中藥物靶標27個，疾病靶標35個，疾病與藥物共有靶標2個；其藥效物質基礎主要為生物堿類、揮發油類、黃酮類、有機酸類等成分。采用分子對接技術進行的虛擬篩選結果表明，“桃仁?紅花?川芎”藥組中的主要活性成分易與ERK2和JNK2形成較好的對接模式與較高的親和力，具有治療腦卒中的活性，也證實了TCMIP V2.0在預測中藥及復方作用機制方面的可靠性。

TCMIP V2.0數據源于ETCM中醫百科全書數據庫，包括中藥數據庫、中藥化學成分數據庫、中藥靶標數據庫、疾病相關分子庫等。設置了3種拓撲結構特征值節點連接度、節點介度、節點緊密度，以確定中藥矯正疾病失衡網絡的候選靶標。通過基因功能分析和通路富集分析，確定靶標基因的生物學功能及其所參與的生物學通路。本研究中借助TCMIP V2.0，以龍生蛭膠囊中的“桃仁?紅花?川芎”藥組為研究對象，初步闡明了此活血化瘀藥組治療腦卒中的作用機制，為龍生蛭膠囊的進一步深入研究提供了理論及數據支持。但本研究結果是基于網絡大數據所做的預測，還需通過進一步研究加以驗證。