膨化大豆發酵制品拮抗高血脂功效研究

蘇靖元，劉曉蘭, 2，叢珊滋,2，李冠龍

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院1，齊齊哈爾 161000)(黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室2，齊齊哈爾 161000)(黑龍江八一農墾大學食品學院3，大慶 163000)

我國高血脂癥高發，并呈現上升趨勢。高血脂癥會誘發脂肪肝、高血壓、動脈粥樣硬化等多種并發癥[1,2]。臨床上治療高血脂癥的藥物主要有他汀類、貝特類藥物等，但長期服用會產生一定的副作用，如肝功能異常、肌肉不良反應等[3,4]。相比藥物治療，選擇食用拮抗血脂功能的功能食品具有副作用低、安全性強等優勢。

發酵豆制品因其悠久的歷史、獨特的風味和較高的食用價值具有重要的地位。發酵豆制品富含多種有益人體健康的活性成分，如大豆多肽、大豆異黃酮、γ-氨基丁酸(GABA)、類黑精素、纖溶因子等，具有促進脂肪代謝、預防心血管疾病、抗氧化應激、溶栓降壓等功效[5-7]。

微波膨化技術在食品工業中得到了廣泛的應用，其具有受熱時間短、物料營養成分破壞少等優點[8]。大豆經微波膨化處理后，適度增加了體積，保留了原有的形狀；高溫對大豆的營養物質產生變化，使蛋白質的空間結構發生改變、淀粉糊化等，且破壞了抗營養因子，有助于提高營養成分的利用率等作用，同時賦予了其特殊的口感和風味[9,10]。

本研究以3種膨化原料發酵豆制品納豆、豆豉和豆醬為原料，建立小鼠高血脂模型，探討其拮抗高血脂癥功效，為拮抗血脂功能食品的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

清潔級ICR小鼠(22± 2)g，許可證號：SCXK(吉)2015-0005；高脂飼料由15%(質量分數，下同)豬油、20%蔗糖、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉、63.6%基礎飼料；大豆、小麥粉：市售；丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

P70D20TL-D4微波爐，BSA124S電子天平，SX-500高壓滅菌鍋，CR21G111高速冷凍離心機，GSP-9270MBE隔水式恒溫培養箱，Alphal-4/1sc真空冷凍干燥機。

1.3 膨化原料發酵豆制品制備方法

1.3.1 納豆的生產方法

原料預處理：選擇顆粒飽滿，粒度均勻，無破皮，無褶皺，無霉變，無蟲蛀的小粒大豆。大豆除塵、清洗，浸泡過夜。

整粒微波：將預處理后的整粒納豆放在微波爐專用保鮮盒內。先在120 W功率下微波40 min，再在450 W功率下微波25 min，使大豆既不全部脹開、又有一定體積膨脹度的適度變性，使其水分減少，口感酥脆即可，冷卻至室溫，密封備用。注意膨化時避免局部過熱，導致膨化不均勻。

浸泡：用3倍處理后原料質量的水進行浸泡，20 ℃恒溫條件下，靜止浸泡1 h，使膨化大豆盡可能充分吸水。

蒸煮：將處理的原料，采用加壓蒸煮方式，將膨化大豆進行加壓蒸煮滅菌處理。利用高壓蒸汽滅菌鍋進行蒸煮，加壓0.1 MPa、121 ℃條件下蒸煮15～20 min。熟豆應為黃褐色，熟而不爛。冷卻準備發酵。

納豆桿菌種子培養液的配制：采用納豆桿菌作為納豆的發酵菌株，先進行擴大培養，采用液體種子擴大培養方法。培養基選用牛肉膏蛋白胨培養基，取一環菌種，接入裝有初始pH 7.0～7.5的50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，37 ℃，180 r/min搖床培養16 h，制備納豆桿菌種子培養液。

發酵培養：將經處理獲得的原料放入無菌室，冷卻至室溫后接種，按6%的含水量加入無菌水和6%的接菌量，將搖床培養16 h的種子培養液接入原料中，混合均勻，將處理后膨化大豆放入37 ℃的恒溫培養箱中恒溫發酵24 h，將發酵后的大豆置4 ℃的冰箱中24 h進行后熟。

1.3.2 豆豉的生產方法

前處理工藝同1.3.1。

制曲培養：經處理獲得的原料冷卻后，將0.2%毛霉菌粉均勻灑在熟料中，翻拌均勻，維持在21～25 ℃，后期注意排水，制曲期間翻曲2次，時間為56～72 h。表面長滿長2 cm左右白色絨毛即可。期間洗曲1次，注意豆曲不宜長時間浸泡在水里，以免含水量增加。

發酵培養：將處理后曲料加入調料，放在45 ℃的恒溫培養箱內入壇密封發酵。具體調料配比添加：黃豆100 g，食鹽8 g，白酒3 g，米酒4 g，冷開水5～10 g，總量配成165～170 g。

1.3.3 豆醬的生產方法

前處理工藝同1.3.1。

制曲培養：將經處理獲得的原料冷卻后拌入干蒸小麥粉，小麥粉與豆子的質量比例是1∶3。接種滬釀米曲霉種曲，接種量為原料質量0.2%，注意混勻。制曲采用2日曲，培養箱32～35 ℃培養。培養12 h左右，曲料發白進行第1次翻曲。表面長出綠色絨毛后進行第2次翻曲。

發酵培養：采用固態低鹽保溫速釀法。以經處理獲得的原料與60～65 ℃鹽水混合成固態醬醅，在45～50 ℃水浴鍋中保溫發酵，注意用棉塞封口，制成固態發酵豆醬。

3種膨化發酵豆制品冷凍抽干后研磨成粉用于灌胃。

1.4 動物分組及飼喂方法

小鼠適應性飼喂1周后，隨機分成12組，每組8只，按清潔級動物飼喂，保持實驗室環境衛生，自由飲食，分籠飼喂3周[11]。動物分組及飼喂方法如表1所示。

表1 小鼠分組及飼喂方法

每日稱量并記錄各組小鼠體重，末次灌胃后，小鼠禁食不禁水12 h，次日稱體重，眼眶取血，靜置后在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min分離血清，將血清保存在-20 ℃冰箱中。解剖小鼠后取出肝臟，用預冷生理鹽水洗去表面血液，濾紙吸干，稱質量，切取一部分肝臟用于制備病理切片，剩下部分用錫箔紙包裹后存放于-80 ℃冰箱中備用。

1.5 指標測定

血清指標測定：取小鼠血清，按照試劑盒說明書測定血清中TG、TC、LDL-C含量。

肝臟指標測定：切取一定質量的肝臟，在冰浴條件下用生理鹽水進行機械研磨，得到質量分數10%的肝組織勻漿，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，得到上清液。按照試劑盒說明書的方法測定肝臟組織中MDA含量以及T-SOD活力。

根據小鼠體重和肝臟質量計算肝臟指數，見式(1)。

(1)

式中：y為肝臟指數/%；m為肝臟質量/g；m0為小鼠體重/g。

1.6 肝臟組織切片觀察

肝臟組織樣品迅速浸泡在體積分數10%甲醛溶液中，脫水后嵌入石蠟內，切成5 μm厚的薄片，經蘇木精-伊紅(HE)染色后進行病理組織觀察。

1.7 數據統計與分析

數據以均數±標準差表示，所有統計分析采用SPASS17.0軟件中Duncan’s 檢驗計算統計學差異的顯著性，P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 小鼠高血脂模型的建立

模型組小鼠經過連續3周飼喂高脂飼料后，小鼠的體重、肝臟形態及血脂含量均發生顯著改變。與對照組相比，模型組小鼠毛發雜亂、毛色不夠鮮亮且小鼠活動度減少。對照組小鼠肝臟呈鮮紅色，模型組小鼠肝臟呈土黃色、具有油膩感。與對照組相比，模型組小鼠血清中的TG、TC、LDL-C含量極顯著升高(P<0.01)，分別提高了72.16%、72.78%、169.05%，表明小鼠高血脂模型建造成功。各組小鼠的血脂含量如表2所示。

表2 各處理組小鼠血脂含量(ˉx±s,n=8)

2.2 膨化原料發酵豆制品對小鼠體重的影響

高血脂癥與肥胖關系密切，體重指標可作為小鼠肥胖程度最直觀的顯示指標之一[12]。膨化原料發酵豆制品對小鼠的體重的影響如表3所示。

表3 膨化大豆原料發酵豆制品對小鼠體重的影響(ˉx±s,n=8)

由表3可知，小鼠的初始體重基本一致，無顯著差異(P>0.05)。經過3周連續飼喂后，各組小鼠的體重均有不同程度的增加。與對照組相比，模型組小鼠體重增量顯著高于對照組(P<0.05)，增加了161.38%，說明通過高脂飲食可以顯著增加小鼠的體重。與模型組相比，陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉各劑量組及豆醬中、高劑量組體重增量顯著下降(P<0.05)。結果表明，經膳食干預后，膨化大豆發酵豆制品對高血脂小鼠的體重增量具有一定的抑制作用，與陽性對照組相一致，且呈良效關系，可以改善高血脂癥所引發的肥胖。

2.3 膨化原料發酵豆制品對小鼠血脂含量的影響

脂類物質通過血液運輸至機體內各個器官與組織之間，血液中的脂類物質含量可以直接反映機體內的脂肪代謝情況[13]。脂類物質指標包括TG、TC、LDL-C，高于正常水平的TG、TC、LDL-C是高血脂癥的重要指標，并可以根據結果估計患心血管疾病的風險[14]。膨化原料發酵豆制品對小鼠血脂含量的影響如表4所示。

表4 膨化大豆原料發酵豆制品對小鼠血脂含量的影響(ˉx±s,n=8)

從表4可以看出，各組小鼠的血脂含量均發生不同程度的變化。與對照組相比，模型組小鼠TG、TC、LDL-C水平極顯著增加(P<0.01)，分別提高了72.16%、72.78%、169.05%，說明通過高脂飲食可以改變小鼠的血脂水平。與模型組相比，陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉各劑量組及豆醬各劑量組TG含量顯著下降(P<0.05)；陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉高劑量組、豆醬中、高劑量組TC含量顯著下降(P<0.05)，豆豉低、中劑量組及豆醬低劑量組也有所下降但不顯著(P>0.05)；陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉低、高劑量組及豆醬各劑量組LDL-C含量顯著下降(P<0.05)，豆豉中劑量組及豆醬低劑量組也有所下降，但不顯著(P>0.05)。因此，高脂飲食可以使小鼠血脂水平增加并引起小鼠脂質含量異常，通過一定劑量膨化大豆發酵豆制品的干預，能夠改善高血脂小鼠的血脂含量，與陽性對照組組相一致，且呈量效關系，降低發生病癥的風險。

發酵豆制品富含多種降血脂功能成分，如納豆激酶、GABA、異黃酮類物質等。謝嵩等[15]采用納豆對高脂模型大鼠進行膳食干預，發現各劑量組能夠顯著降低血清中TC、TG的含量，表現出良好的降血脂功效。Yeap等[16]發現發酵綠豆富含GABA，并采用發酵綠豆、未發酵綠豆對高脂模型小鼠進行膳食干預，發現發酵綠豆降血脂及保護肝臟能力顯著高于未發酵綠豆。張亮[17]采用大豆異黃酮對高脂模型大鼠進行膳食干預，發現各劑量組能顯著降低血清中TC、TG、LDL-C、MDA含量，顯著提高血清中SOD、GSH-PX、T-AOC水平。李曉玲[18]采用大豆異黃酮對蛋雞進行膳食干預，發現各劑量組能顯著降低血清和蛋黃中TC、TG、LDL-C、MDA的含量。膨化大豆發酵豆制品具有一定的降血脂功效，可能是由于多種活性物質的協同作用，從而改善血脂異常并起到一定預防高血脂癥的功效。

2.4 膨化原料發酵豆制品對小鼠肝質量及肝臟指數的影響

臟器指數又稱臟體比，是指試驗動物某個臟器質量與其體重的比值。肝臟是機體內參與脂質代謝的重要器官。研究發現，高脂飲食會引起肝臟脂代謝紊亂，脂肪在肝臟過度堆積，導致肝臟重量發生改變，肝臟指數也隨之變化，故肝臟指數可以反映各組小鼠肝臟的損傷程度[19]。膨化原料發酵豆制品對小鼠的肝質量及肝臟指數的影響如表5所示。

表5 膨化大豆原料發酵豆制品對小鼠肝質量及肝臟指數的影響(ˉx±s,n=8)

從表5可以看出，各組小鼠的肝質量、肝臟指數發生不同程度的變化。與對照組相比，模型組小鼠肝質量、肝臟指數顯著提高(P<0.05)，分別提高了30.52%、19.77%，表明通過高脂飲食改變了小鼠的肝臟質量、肝臟指數，影響了脂肪代謝情況。與模型組相比，陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉各劑量組及豆醬各劑量組肝質量顯著下降(P<0.05)；陽性對照組及各劑量組肝臟指數有所下降但不顯著(P>0.05)。高脂飲食可以使小鼠肝臟質量占比增加并引起小鼠肝臟脂肪堆積，造成肝臟增生肥大。通過膳食干預，膨化大豆發酵豆制品可以降低小鼠肝臟內部的脂肪蓄積并加速體內脂質的轉運、排泄，改善高脂飲食小鼠的肝重及肝臟指數。

2.5 膨化原料發酵豆制品對小鼠肝臟MDA和T-SOD水平的影響

高血脂癥通常伴隨著氧化應激和脂質過氧化，并引發機體抗氧化體系異常，從而加劇高血脂癥進一步發展[20]。MDA是引發機體脂質過氧化作用的最終產物之一，對生物膜系統有破壞作用[21]。因此，MDA含量可以間接反映機體過氧化損傷程度。SOD是機體內重要的抗氧化酶之一，具有清除機體內自由基的功能，保護組織細胞免受傷害[22]。機體內SOD含量的高低可以反映機體的抗氧化能力。膨化原料發酵豆制品對小鼠肝臟中MDA、T-SOD含量的影響如表6所示。

表6 膨化大豆原料發酵豆制品對小鼠肝臟中MDA、T-SOD含量的影響(ˉx±s,n=8)

由表6可知，各組小鼠肝臟中MDA和T-SOD含量發生不同程度的變化。與對照組相比，模型組小鼠MDA含量顯著提高了95.98%、T-SOD含量顯著下降了28.43%(P<0.05)，表明高脂飲食可以使機體內氧化系統發生改變，產生氧化應激反應。與模型組相比，陽性對照組、豆豉各劑量組、豆醬中、高劑量組MDA含量顯著下降(P<0.05)，納豆各劑量組及豆醬低劑量組也有所下降但不顯著(P>0.05)；陽性對照組、納豆各劑量組、豆豉各劑量組及豆醬各劑量組T-SOD含量顯著提高(P<0.05)。以上結果表明，一定劑量膨化大豆發酵豆制品可以降低由高脂飲食誘導的小鼠體內脂質過氧化產物的含量，并提高體內抗氧化酶活性，與陽性對照組組相一致，且呈量效關系。

血脂異常導致機體抗氧化能力下降，氧自由基的增多引起脂質過氧化從而加劇高血脂癥。發酵豆制品富含多種抗氧化功能成分，如類黑精素、異黃酮類物質等。Mohd等[23]利用豆豉對肝臟損傷模型小鼠進行膳食干預，豆豉提取物能夠顯著降低TC、TG、MDA、AST、ALT含量，顯著提高SOD含量，并發現小鼠肝細胞微泡脂肪變性減少。劉敏等[24]發現毛霉型豆豉、曲霉型豆豉中的類黑精素具有較強的抗氧化能力。Ahmad等[25]對未發酵和發酵大豆中異黃酮進行比較，發現經過發酵可以使異黃酮含量增加、抗氧化能力增強。膨化原料發酵豆制品的抗氧化作用可能是由于類黑精素和大豆異黃酮的協同作用減緩氧化應激，達到預防高血脂癥并保護肝臟的作用。

血脂異常與氧化應激反應密切相關，氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)是LDL在大量活性氧的作用下發生過氧化反應的產物，最終產生MDA。OX-LDL也是形成泡沫細胞的主要因素，而泡沫細胞是血脂異常階段具有特征性的細胞，MDA也會促進機體TC積累[26]，從而加劇高血脂癥。

2.6 膨化原料發酵豆制品對小鼠肝臟組織病理變化的影響

各組小鼠肝臟組織切片如圖1所示。對照組小鼠肝細胞排列緊密，肝竇清晰可見，未出現脂肪空泡、無脂肪變性和脂肪壞死等現象。模型組小鼠肝細胞排列松散無序，完整性較差，結構輪廓模糊，有大量脂肪空泡的出現，形態不完整。與模型組相比，陽性對照組及各試驗組可不同程度改善小鼠肝臟細胞脂肪變性，脂肪滴空泡有所減少。結果表明，膨化原料發酵豆制品對小鼠脂肪肝變性程度具有改善作用。

圖1 小鼠肝組織HE染色(100×)

3 結論

本實驗研究了3種膨化大豆發酵豆制品拮抗高血脂癥功效，研究表明膨化大豆發酵豆制品均能不同程度改善高血脂癥小鼠的血脂水平及肝臟損傷，降低小鼠體內脂質過氧化產物的含量，提高機體的抗氧化能力，達到拮抗高血脂的功效。膨化大豆發酵豆制品有一定的拮抗血脂異常作用，其機制有待進一步研究。