間充質干細胞聯合燈盞花素基于Galectin-3/Akt/Snail通路對腎臟纖維化的影響研究

張宇韋，李健春，鐘 霞，湯華軍，陳 波

(1.西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000；2. 西南醫科大學基礎醫學院，四川 瀘州 646000)

各種病理因素導致的慢性腎臟病(CKD)是人類心血管疾病、早衰及終末期腎病的主要風險因素。我國成年人CKD發病率為8%～12%[1]，其具有發病率高、伴發心血管病率高、病死率高的特點，給醫療系統和家庭帶來沉重負擔。腎臟纖維化是各種慢性腎病進程中的主要病理變化，抗纖維化治療仍是治療重點和難點，單一方法治療腎組織病理改變不明顯，腎功能恢復不理想。中醫認為纖維化形成主要由氣血壅滯、經絡痹阻、痰濕搏結或三者相輔作用而成，治療主要選用活血化瘀、益氣養陰、清熱散結類中藥，其中活血化瘀類藥物抗腎纖維化作用佳[2]?；钛鲱愔兴師舯K花素是從燈盞細辛中提取的黃酮類化合物，具有解毒、祛風除濕、活血化瘀、通經活絡、消炎止痛及抗凝、抗血栓形成、改善血液流變性及微循環、提高機體耐缺氧能力等作用，主要用于心腦血管疾病[3]、高血壓腎病[4]、糖尿病腎病[5]、肝纖維化[6]等的治療。Jiang等[7]報道燈盞花素可通過磷酸化PKCβⅡ/Akt/JNK1/2/p38信號通路改善糖尿病腎病小鼠腎臟纖維化。但燈盞花素單獨治療CKD纖維化療效有限。間充質干細胞(MSCs)是目前最有應用前景的干細胞之一，和腎臟發育具有中胚層同源性。文獻報道MSCs無論是單獨應用，還是與生長因子聯用，均能延緩CKD疾病進展，有效改善腎功能[8-9]。MSCs可能是通過抑制上皮間質轉分化(EMT)、自分泌或過表達各種生長因子或免疫調節作用延緩CKD病程進展達到抗纖維化作用[10]。本實驗利用MSCs在體外易獲得擴增、低免疫原性、具有細胞因子分泌能力和免疫調節能力等優勢，觀察了MSCs與燈盞花素聯合抗CKD腎臟纖維化的效果和可能機制。

1 實驗材料和方法

1.1實驗動物 雄性健康SD大鼠50只，體重250～280 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(川)2019-17。大鼠飼養在恒溫20～22 ℃、濕度50%～60%環境中，晝夜12 h/12 h交替，適應性飼養1周后進行實驗，操作符合西南醫科大學實驗動物倫理委員會要求(2020773)。

1.2主要藥物及試劑 燈盞花素購自湖南恒生制藥股份有限公司(國藥準字Z20063405)。MSCs無血清專用培養基(N6010)購自北京索萊寶科技有限公司。一抗I型膠原A1(ColIA1)(# 72026)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA，#19245)、Galectin-3(# 87985)、Snail1 (#3879)、p-Akt(#4060)和Akt(#2920)抗體購自Cell Signaling Technology，基質金屬蛋白酶-9(MMP-9，ab38898)抗體購自Abcam。血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Sirius Red染色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；Masson染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。MSCs流式細胞表型鑒定抗體包括陽性標記CD44-PE(ab23396)、CD29-PE/Cy7 (ab95622)和陰性標記CD45-FITC (ab33916)均購自Abcam公司，CD34-FITC (11-0341-82)購自 eBioscience。油紅O(G1262，北京索萊寶科技有限公司),茜素紅(ZY121105，上海澤葉生物科技有限公司)。

1.3骨髓源性MSCs原代培養和鑒定 取10只健康雄性SD大鼠[西南醫科大學實驗動物中心，合格證號：SYXK(川)2018-065]，體重120～140 g，無菌條件取出雙下肢股骨和脛骨，用注射器從骨兩端打孔后用無菌PBS沖出骨髓，收集骨髓，1 000 r/min離心(離心半徑380 mm)3 min后去上清，用無血清MSCs專用培養基重懸細胞后，來自每只大鼠的骨髓懸液接種2瓶細胞(5×106/瓶)，72 h后全量換液，體外按照1∶3比例傳代。傳至第3代，細胞經流式表面抗原檢測，CD29、CD44和CD90呈強陽性表達，CD34和CD45呈陰性表達；油紅O染色發現大小不一紅色脂滴，證實MSCs有明顯成脂能力；茜素紅染色試劑盒檢測顯示橘紅色鈣沉積礦化結節，證實MSCs有明顯成骨能力。

1.4分組、建模及干預 將50只健康雄性SD大鼠稱重后隨機分為正常組、模型組、燈盞花素組、MSCs組、燈盞花素+MSCs組，每組10只。除正常組外，其余組大鼠采用阿霉素5 mg/kg尾靜脈一次注射加腺嘌呤150 mg/kg連續灌胃15 d方法誘導建立CKD模型。建模結束后，燈盞花素組給予燈盞花素25 mg/kg連續灌胃7 d；MSCs組在建模結束后第3天，尾靜脈注射無菌生理鹽水MSCs細胞懸液2×106/kg；燈盞花素+MSCs組給予燈盞花素連續灌胃7 d，同時建模結束后第3天尾靜脈注射無菌生理鹽水MSCs細胞懸液2×106/kg。

1.5檢測指標及方法

1.5.1腎功能和腎臟指數 實驗結束后第3天收集24 h尿液，檢測24 h尿蛋白；經10%水合氯醛麻醉大鼠后取血，檢測血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平；處死大鼠后取腎臟，計算腎臟指數(腎臟重量/鼠重×100%)。

1.5.2腎臟組織病理觀察 取各組大鼠部分腎臟組織，經4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋進行常規病理切片，分別采用HE染色、Masson染色和Sirius Red染色進行腎組織病理觀察。

1.5.3腎臟組織中ColIA1、MMP-9表達情況 采用免疫組織化學SP法檢測：取制備好的各組大鼠腎臟組織石蠟切片，脫蠟梯度復水，置檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中微波抗原修復，自然冷卻至室溫，現配3%過氧化氫孵育10 min，PBS洗3次。滴加 5% BSA封閉30 min后甩干，滴加一抗，4 ℃濕盒孵育過夜。PBS洗滌3次，滴加辣根過氧化物酶標記的對應二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，DAB顯色，鏡下控制顯色時間，蒸餾水沖洗終止反應。蘇木素復染核后水洗，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，每個樣本采圖3～5張，計算ColIA1、MMP-9陽性標記面積累計光密度IOD值。

1.5.4腎臟組織中Galectin-3/Akt/Snail通路相關因子表達情況 采用Western blot法檢測：取各組大鼠腎臟組織200 mg，液氮研磨后加入300 μL RIPA裂解液置冰上振搖30 min，超聲后離心取上清，采用BCA蛋白定量后，加入5×Loading buffer，95 ℃煮沸10 min，小份分裝置-20 ℃冰箱凍存。上樣量40 μg，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉膜后5%脫脂奶粉或5%BSA(磷酸化蛋白)封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，每次5 min。加對應二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用高敏ECL顯色試劑孵育1～2 min后凝膠成像系統自動成像。用Gel-Pro Analyzer軟件測量灰度值，GAPDH為內參蛋白。

2 結 果

2.1各組大鼠腎功能和腎臟指數比較 實驗結束后，模型組24 h尿蛋白、血清Cr和BUN水平及腎臟指數均明顯高于正常組(P均<0.05)；燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組各指標均明顯低于模型組(P均<0.05)，各干預組間各指標比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 正常組和慢性腎臟病各組大鼠腎臟指數和腎功能指標比較

2.2各組大鼠腎臟組織病理表現 HE、Masson和Sirius Red染色顯示，模型組腎組織結構紊亂，炎性細胞浸潤明顯，腎小管腔內腺嘌呤結晶沉著，腎小管管腔擴張或萎縮，腎間質膠原纖維化明顯增加，腎小球毛細血管擴張、系膜增厚。燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組腎組織病理改變明顯較模型組輕，其中燈盞花素+MSCs組最輕。見圖2。

圖2 正常組和慢性腎臟病各組大鼠腎臟組織HE、 Masson和Sirius Red染色表現(×200)

2.3各組大鼠腎臟組織中ColIA1、MMP-9表達情況 免疫組化染色顯示，ColIA1主要表達于腎小管間質中，模型組ColIA1陽性標記面積累計光密度IOD值明顯高于正常組(P<0.05)，燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組均明顯低于模型組(P均<0.05)，MSCs組和燈盞花素+MSCs組陽性標記更少；MMP-9主要表達于腎小管上皮細胞胞漿中，模型組MMP-9陽性標記面積累計光密度IOD值明顯低于正常組(P<0.05)，燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組均明顯高于模型組(P均<0.05)，MSCs組和燈盞花素+MSCs組陽性標記更明顯。見圖3及圖4。

圖3 正常組和慢性腎臟病各組大鼠腎臟組織中ColIA1和MMP-9免疫組化染色表現

圖4 正常組和慢性腎臟病各組大鼠腎臟組織中ColIA1和MMP-9陽性標記面積累計光密度IOD值比較

2.4各組大鼠腎臟組織中Galectin-3/Akt/Snail通路相關因子表達情況 模型組腎臟組織中p-Akt/Akt、α-SMA、Galectin-3、Snail1表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組均明顯低于模型組(P均<0.05)，燈盞花素+MSCs組p-Akt/Akt、Snail1表達量明顯低于燈盞花素組和MSCs組(P均<0.05)，燈盞花素組和燈盞花素+MSCs組Galectin-3表達量明顯低于MSCs組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 正常組和慢性腎臟病各組大鼠腎臟組織中p-Akt、α-SMA、Snail1和Galectin-3蛋白表達情況

3 討 論

燈盞花素主要用于心腦血管疾病的治療，尤其在高血壓誘導性腎病中和抗高血壓類藥物聯用能明顯降低24 h尿蛋白，顯著改善腎功能[4]，但也有文獻報道燈盞花素在高劑量時不僅不能起到降壓作用反而有升壓作用[11]。Mei等[12]報道，在經典的單側輸尿管結扎模型中，燈盞花素可通過抑制腎臟對水鈉轉運蛋白的下調起到腎臟保護作用。Liu等[13]研究發現，燈盞花素可以通過抑制巨噬細胞募集、減輕氧化應激以及調節血脂異常而降低尿蛋白，改善腎功能。本實驗結果顯示，實驗結束后，燈盞花素組24 h 尿蛋白、血清Cr和BUN水平、腎臟指數及腎臟組織中ColIA1陽性標記面積累計光密度IOD值、α-SMA表達量均明顯低于模型組，MMP-9陽性標記面積累計光密度IOD值明顯高于模型組。提示燈盞花素單獨應用可改善腎功能，能減少腎臟組織膠原成分ColIA1和肌成纖維細胞標志物α-SMA表達，可增加具有降解腎小管間質中細胞外基質作用的MMP-9表達，證明其有一定程度的抗纖維化作用。

Galectin-3是一種IgE、層黏連結合蛋白，對β-半乳糖苷有高親和力，通過碳水化合物識別結構域的N-連接或O-連接的糖基化作用與β-半乳糖苷糖結合[14]。Galectin-3在胞外涉及細胞-細胞和細胞-細胞外基質黏附，細胞生長和分化，細胞凋亡和血管生成等功能；在細胞核中作為前mRNA剪接因子，參與急性炎癥反應，包括中性粒細胞活化和黏附、單核細胞巨噬細胞的化學吸引、凋亡中性粒細胞的調理素作用、肥大細胞的活化[15]?，F已經證實Galectin-3獨特表達于心、腎、血管等器官以及巨噬細胞、上皮細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞等細胞[16]，其由腎、肝和心臟纖維化中活化的肌成纖維細胞分泌，且其血清水平的上升早于CKD的發生，已被提出作為評價腎臟纖維化進程以及心、肝纖維化進程新的生物學標志物[17]。本實驗結果顯示，模型組腎臟組織中Galectin-3表達量明顯高于正常組，燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組均明顯低于模型組，燈盞花素組和燈盞花素+MSCs組Galectin-3表達量有明顯低于MSCs組的趨勢。提示燈盞花素抑制CKD后腎臟組織Galectin-3表達可能是其發揮抗纖維化作用的重要原因，MSCs單獨應用雖也能減少Galectin-3表達，但抑制作用不如單用燈盞花素，這可能和MSCs自身能分泌Galectin-3有關[18]。

根據現有文獻和Galectin-3功能推測，Galectin-3的促纖維化機制可能與整合素家族某些成員發生作用，一方面影響了Integrin/ILK的表達，進一步激活Akt或者GSK-3β磷酸化，使下游促纖轉錄因子Snail、Twist等下調，激活EMT[19-20]；另一方面Integrin家族成員可能和TIMP家族成員發生作用，影響了MMPs家族成員活性，導致細胞外基質(ECM)生成和降解失衡，ECM表達增加，促進了纖維化進程。因此檢測上述重點指標，結果顯示模型組腎臟組織中p-Akt/Akt、Snail1表達量均明顯高于正常組，燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組均明顯低于模型組，燈盞花素+MSCs組p-Akt/Akt、Snail1表達量明顯低于燈盞花素組和MSCs組。提示燈盞花素可抑制腎臟組織Akt磷酸化，下調Snial1表達，部分說明燈盞花素可能通過Galectin-3/Akt/Snail信號通路發揮抗纖維化作用。同時MSCs可以抑制Akt磷酸化及Snial1表達而產生抗纖維化效果，在和燈盞花素聯合應用時，抑制效果更明顯。

綜上所述，活血化瘀類中藥燈盞花素和MSCs可能通過調控Galectin-3/Akt/Snail通路協同發揮更好的抗CKD腎臟纖維化作用，為臨床治療各類慢性腎病纖維化提供了新的思路，但二者抗纖維化機制還需要進一步深入研究探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。