小檗堿改善多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗大鼠子宮組織局部胰島素抵抗的作用機制研究

李慕白，王婷婷，張多加，吳效科，張明明

(1. 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150000；2. 黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡婦女常見的內分泌疾病，高胰島素血癥和胰島素抵抗(IR)是PCOS患者的重要特征，臨床中50%～75%的PCOS患者伴有不同程度的IR[1]。高胰島素血癥是促進高雄激素血癥的原因之一，胰島素可以協同促黃體生成素(LH)促進卵巢膜細胞雄激素的生成[2]。PCOS患者IR常伴隨著血脂代謝異常，同時還增加患肥胖癥、心血管疾病、2型糖尿病的風險[3]。有研究表明，PCOS患者子宮內膜局部IR可以降低子宮內膜容受性，影響妊娠率[4]，甚至可能參與女性不孕癥的發展[5]，同時也增加了子宮內膜異常增生的風險[6]，因此，PCOS患者子宮內膜局部IR對生殖功能障礙和子宮內膜異常增生有重要影響。小檗堿是從中藥黃連的根、莖、皮中提取的一種季銨鹽，其具有良好的降血糖和降血脂作用，是一種有效的胰島素增敏劑[7]，在改善糖脂代謝和增強胰島素敏感性方面與二甲雙胍作用相似，但其降低LH、總睪酮(T)和LH/卵泡刺激素(FSH)的作用優于二甲雙胍[1]。目前研究認為小檗堿可通過調節胰島素信號通路改善PCOS患者IR[8]，但其具體機制仍有待研究。本實驗應用胰島素聯合人絨毛膜促性腺激素(HCG)建立PCOS伴IR大鼠模型，通過觀察小檗堿對大鼠糖脂代謝、甾體激素水平及子宮組織胰島素信號通路相關靶基因和GLUT4基因表達的影響，探討了小檗堿改善PCOS全身IR及子宮組織局部IR的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，鼠齡44～50 d，體重160～170 g，購自哈爾濱光大動物養殖技術中心,動物生產許可證號：SCXK(黑)2018-003。所有大鼠均適應性喂養1周，自由飲水，光照/暗時間為12 h/12 h循環，室溫20～24 ℃，相對濕度50%。

1.2主要試劑 精蛋白生物合成人胰島素注射液(丹麥諾和諾德公司，批號：J20171005)；注射用絨促性素(麗珠集團麗珠制藥廠，批號：200309)；鹽酸小檗堿片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：2190612)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20023370)。大鼠INS、T、LH、FSH、雄烯二酮(ASD)、17-羥孕酮(17-OHP)、性激素結合球蛋白(SHBG)、雌激素(E2)ELISA試劑盒均購自上海舜冉生物科技有限公司。兔抗大鼠多克隆磷酸化IRS1-Ser307抗體和兔抗大鼠單克隆GSK3β抗體購自Cell Signaling Technology公司；兔抗大鼠單克隆磷酸化AKT1-S473抗體購自Abcam公司。qPCR試劑盒(KK4601)購自KAPA Biosystems公司。

1.3主要儀器 離心機(賽默飛Sorvall ST 40、SCILOGEX)，生化分析儀(邁瑞BS200)，正置光學顯微鏡(日本尼康NIKON ECLIPSE CI)，包埋機(武漢俊杰電子有限公司JB-P5)，酶標分析儀(Infinite F50)，電泳儀(美國BioRad POWERPAC HC POWER SUPPLY、北京君意東方電泳設備有限公司)，實時熒光定量PCR儀(ABI公司 ABI7500)。

1.4實驗方法 隨機將大鼠分為空白組、PCOS組、小檗堿組、二甲雙胍組，每組15只。PCOS組、小檗堿組、二甲雙胍組參考文獻[9]采用胰島素+HCG頸背部皮下注射方法建立PCOS伴IR模型：造模第1天，每只大鼠頸背部皮下注射胰島素0.5IU/次，1次/d，每日增加0.5 IU，逐漸遞增至6.0 IU/d，第12天后維持6.0 IU/d劑量直至造模第22天；從造模第14天開始，每只大鼠皮下注射HCG 6.0 IU/d，分2次注射，直至造模第22天?？瞻捉M給予等劑量生理鹽水頸背部皮下注射。造模結束后，二甲雙胍組給予二甲雙胍溶液200 mg/kg灌胃，小檗堿組給予鹽酸小檗堿混懸液170 mg/kg灌胃，空白組和PCOS組大鼠每日給予等容量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續31 d。

1.5.1動情周期 造模結束后，對PCOS組、小檗堿組、二甲雙胍組大鼠進行陰道涂片觀察陰道上皮角化程度，4 d為1個周期，連續觀察3個周期；灌胃第19天開始，再次對PCOS組、小檗堿組、二甲雙胍組大鼠進行陰道涂片觀察陰道上皮角化程度，4 d為1個周期，連續觀察3個周期。

1.5觀察指標及方法

(2)試驗梁跨中撓度和支座處結合面滑移：均采用位移計。在梁端支座處布置一個位移計，用來測量支座處結合面滑移，試驗梁跨中處布置一個位移計用來測量跨中撓度。

1.5.2口服葡萄糖耐量試驗(OGTT) 灌胃干預結束后第2天，各組大鼠禁食12 h后先空腹采血，再給予50%葡萄糖溶液3 g/kg灌胃，分別于灌胃后第60 min、120 min、180 min尾靜脈取血，檢測各時間段血糖水平。

1.5.3激素及血脂水平 灌胃干預結束后，禁食，次日對處于動情間期的大鼠眼眶靜脈取血，全血離心后取血清置于-80 ℃冰箱，采用酶聯免疫吸附法檢測血清空腹胰島素(FINS)、LH、SHBG、FSH、E2、T、ASD、17-OHP水平，采用生化法檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.5.4子宮病理形態觀察 各組大鼠采血后斷頸處死，取出子宮，每只大鼠取一半子宮用10%福爾馬林固定液固定，常規石蠟包埋、切片，行蘇木素-伊紅染色(HE)，并應用3D HISTECH軟件，運用腸絨毛高度和隱窩深度測量方法測量子宮各檢測位點(肌層厚度、腔上皮細胞高度、腺腔大小)。

1.5.5子宮組織中pIRS1-Ser307、pAKT-S473、GSK3β蛋白表達情況 采用Western blot法進行檢測：從-80 ℃冰箱中取出各組大鼠液氮凍存的另一半子宮，按10%勻漿后取組織40 mg加入400 μL RIPA裂解液(磷酸化蛋白需同時加入磷酸酶抑制劑)，30000r/min勻漿10min，13000r/min離心20 min，取上清；用BCA法蛋白定量，上樣后電泳、轉膜，加入相應一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后室溫孵育二抗40 min，化學發光法ECL顯影；圖片掃描，使用軟件Gel Image ststem ver.4.00(tanon,china)對圖像進行灰度分析。

1.5.6大鼠子宮組織中GLUT4 mRNA表達情況 使用ncbi-primer合成引物，提取樣本總RNA，將1 mL TRIzol懸液劇烈振蕩20 s，按比例加入氯仿，劇烈振蕩15 s后室溫放置2 min，12 000 r/min離心10 min，將上層水相移到新管中，并加入1倍體積的70%乙醇混勻，將得到的溶液轉到Spin Column RM中，12 000 r/min離心20 s，丟棄廢液，進行DNase 1消化后，將放回的Spin Column RM以12 000 r/min離心1 min，Spin Column RM轉管，加30 μL RNase-free Water，室溫放置1 min，12 000 r/min離心1 min；用1%瓊脂糖凝膠進行電泳質檢；使用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒(康為世紀，CW2569)進行反轉錄；并使用ABI7500熒光定量PCR儀進行Real-time PCR；采用2-△△ct方法進行數據的相對定量分析。具體引物序列：GLUT4前向引物為5’-GGCCGGGACACTATACCCTAT-3’，反向引物為5’-GACCAGTGTCCCAGTCACTC-3’，長度138 bp；ACTb前向引物為5’-GCACCATGAAGATCAAGATCATT-3’，反向引物為5’-TAACAGTCCGCCTAGAAGCATT-3’，長度172 bp。

2 結 果

2.8各組大鼠子宮組織中GLUT4 mRNA表達情況PCOS組大鼠子宮組織中GLUT4 mRNA相對表達量明顯低于空白組(P<0.05)；小檗堿組和二甲雙胍組大鼠子宮組織中GLUT4 mRNA相對表達量均明顯高于PCOS組(P均<0.05)，小檗堿組和二甲雙胍組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

從表1可以得出，由于主輔隔離帶沿線存在空間不連續、噴灑方向與路拱橫坡相反以及工程量大等缺點，對于安裝噴灑裝置難度更大、成本更高，安裝后噴灑的預期效果也不理想。相比較而言，噴灑裝置安裝在空間連續、施工作業面較少的中央隔離帶，不但工程量合理、施工較為方便，而且由于噴灑方向與路拱橫坡一致，噴灑的效果也會更好。因此，噴灑裝置安裝位置應選在中央隔離帶。

2.2各組大鼠OGTT各時間段血糖水平比較 PCOS組大鼠OGTT各時間段血糖均明顯高于空白組(P均<0.05)；小檗堿組和二甲雙胍組大鼠OGTT各時間段血糖均明顯低于PCOS組(P均<0.05)，小檗堿組和二甲雙胍組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白組和多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗各組大鼠OGTT各時間段血糖水平比較

2.7各組大鼠子宮組織中pIRS1-Ser307、pAKT-S473、GSK3β蛋白表達情況 與空白組比較，PCOS組大鼠子宮組織中pIRS1-Ser307、GSK3β蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05)，pAKT-S473蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05)；與PCOS組比較，小檗堿組和二甲雙胍組大鼠子宮組織中pIRS1-Ser307、GSK3β蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05)，pAKT-S473蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05)，小檗堿組和二甲雙胍組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖4。

表2 空白組和多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗各組大鼠血清甾體激素水平比較

組別只數17-OHP/( x±s,ng/mL)SHBG/( x±s,nmol/L)T/( x±s,ng/dL)ASD/[M(P25,P75),nmol/L]空白組152.28±0.5358.27±3.7934.08±2.9611.25(10.58,11.46)PCOS組153.56±0.74①33.14±4.82①50.20±12.29①20.44(19.55,20.73)①小檗堿組152.80±0.36②47.72±2.55②③39.05±1.72②14.29(14.16,14.79)②③二甲雙胍組152.82±0.33②42.62±3.16②43.11±4.16②16.65(16.48,17.25)②

2.4各組大鼠血清FINS、HOMA-IR及血脂指標比較 PCOS組大鼠血清FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，HDL-C水平明顯低于空白組(P<0.05)。小檗堿組和二甲雙胍組大鼠血清FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C水平均明顯低于PCOS組(P均<0.05)，HDL-C水平與PCOS組比較差異無統計學意義(P均>0.05)；小檗堿組大鼠血清FINS水平明顯低于二甲雙胍組(P<0.05)，HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平與二甲雙胍組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

根據本條規定，一是公布評估師名單的主體是有關全國性評估行業協會。二是公布的評估師名單應當包括所有通過有關專業類別評估師資格的評估專業人員。三是評估師名單應當實時更新，例如應當及時補充新通過資格考試的評估師，對已經死亡或者喪失民事行為能力的評估師，應當及時從名單中去除。四是有關全國性評估行業協會應當在其網站上公布評估師名單，便于委托人和社會公眾查詢。

表3 空白組和多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗各組大鼠血清FINS、HOMA-IR及血脂指標比較

2.5各組大鼠子宮形態學表現 空白組大鼠子宮腔上皮細胞呈單層柱狀，未見空泡；子宮腺腔未見擴張，腺腔內無分泌液；子宮肌層厚度正常。PCOS組大鼠子宮腔上皮細胞高度增加，細胞質與細胞核比例增高，可見假復層，少量上皮細胞胞質空泡化；可見少量子宮腺擴張；子宮肌層厚度增加。與PCOS組相比，小檗堿組和二甲雙胍組子宮腔局部上皮細胞高度降低，未見假復層，上皮細胞胞質未見空泡；子宮腺腔未見擴張；子宮肌層厚度變薄。見圖1～3。

推薦理由:本書為原中國殘疾人聯合會副主席王新憲回憶錄。文稿敘述平實感人，按時間順序記述了作者從1968年至2000年之間的生活和工作經歷，即從中學時代到進入社會，從工廠勞動至殘聯工作的一段人生歷程。作者雖然從小就身體不便，但行文中卻沒有一絲怨天尤人和對人生及社會的不滿，整篇文稿都充滿了積極向上的正能量和對親人朋友的感激之情。

圖1 空白組和多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗各組大鼠子宮腔上皮細胞HE染色表現(×400)

圖2 空白組和多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗各組大鼠子宮腺腔HE染色表現(×400)

圖3 空白組和多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗各組大鼠肌層厚度HE染色表現(×100)

2.6各組大鼠子宮肌層厚度、腔上皮細胞高度和腺腔大小比較 PCOS組大鼠子宮肌層厚度、腔上皮細胞高度和腺腔大小均明顯高于空白組(P均<0.05)；小檗堿組和二甲雙胍組大鼠子宮肌層厚度、腔上皮細胞高度和腺腔大小均明顯低于PCOS組(P均<0.05)，小檗堿組和二甲雙胍組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表4。

表4 空白組和多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗各組大鼠子宮肌層厚度、腔上皮細胞高度和腺腔大小比較[M(P25，P75)]

2.3各組大鼠血清甾體激素水平比較 與空白組比較，PCOS組大鼠血清LH、17-OHP、T、ASD水平和LH/FSH均明顯升高(P均<0.05)，SHBG水平明顯降低(P<0.05)。與PCOS組比較，小檗堿組和二甲雙胍組大鼠血清LH、17-OHP、T、ASD水平和LH/FSH均明顯降低(P均<0.05)，SHBG水平均明顯升高(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，小檗堿組大鼠血清LH、ASD水平更低(P均<0.05)，SHBG水平更高(P<0.05)；各組大鼠血清FSH、E2水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

圖4 空白組和多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗各組大鼠子宮組織胰島素信號通路相關靶基因蛋白表達情況

2.1各組大鼠動情周期 造模結束后，光鏡下觀察可見大鼠陰道上皮細胞持續處于以大量白細胞為主的動情間期，提示造模后大鼠動情周期紊亂，造模成功。小檗堿組和二甲雙胍組大鼠灌胃19 d后陰道涂片可見以角化上皮細胞為主的動情期，逐漸恢復4～5 d的正常動情周期。

下丘腦-垂體功能障礙是PCOS的病因之一[18]，下丘腦Kisspeptin是內分泌和代謝信號的靶標[19]。Esparza等[20]報道，PCOS小鼠Kisspeptin信號水平升高，血清LH增加。張多加等[21]研究發現，PCOS患者血清中Kisspeptin濃度和脈沖頻率明顯升高，而Kisspeptin對葡萄糖刺激的胰島素分泌有促進作用，小檗堿可能通過下丘腦-垂體軸降低血清LH水平，進而改善PCOS生殖內分泌紊亂。本實驗結果顯示，小檗堿組和二甲雙胍組大鼠血清LH、17-OHP、T、ASD水平和LH/FSH均明顯低于PCOS組，SHBG水平均明顯高于PCOS組；且小檗堿組大鼠血清LH、ASD水平明顯低于二甲雙胍組，SHBG水平明顯高于PCOS組。提示小檗堿可明顯改善PCOS伴IR大鼠的生殖內分泌紊亂。

圖5 空白組和多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗各組大鼠子宮組織中GLUT4 mRNA相對表達量

3 討 論

IR作為PCOS患者的特征之一，可導致PCOS患者出現肥胖、多毛、痤瘡、黑棘皮、不孕等臨床特征，增加PCOS患者患2型糖尿病的風險[10]。有研究發現，在胰島素聯合HCG的干預下，成年大鼠出現卵泡囊性擴張[11]、卵巢局部組織IR[12]、糖代謝障礙和高胰島素血癥等PCOS特征，且還能導致大鼠卵巢和子宮出現形態改變和功能障礙[13]。本實驗結果顯示，造模后大鼠動情周期和糖脂代謝紊亂，LH/FSH和HOMA-IR均明顯增高，大鼠出現高雄激素血癥，子宮出現形態學改變，pIRS1-Ser307高表達，證實胰島素聯合HCG法造模的大鼠呈現PCOS伴IR狀態。

小檗堿對PCOS患者生殖功能具有改善作用，可調節月經周期，其誘導排卵的效果達到一線促排卵藥克羅米芬的水平[14-15]。小檗堿還可通過調節下丘腦-垂體-卵巢軸(HPOA)減少類固醇激素的合成和卵巢芳香化酶的表達[16]，改善PCOS患者的IR狀態，減輕體重[17]。臨床觀察發現小檗堿不良反應短暫且溫和，在PCOS患者的長期治療中具有安全性，具有廣闊的應用前景[14]。

由于室內外會有較大溫差的存在，所以導致建筑在使用過程中，由于外圍護結構是直接和外界接觸的，彼此之間會存在熱傳導的情況。在這種情況下，圍護結構中的一些部位如果對應的傳導系數存在差異，則很容易發生外部溫度較高，材料內部溫度較低的情況。在這種情況下，熱傳導很難快速完成，所以在熱傳導的過程中就會有能量損失的情況發生。也正是因為如此，所以有一些建筑在使用過程中會有較大的能耗出現。

小說的創作離不開“時空”，也離不開小說故事情節的授予者，即小說中的人物?？臻g敘事的手法雖然學界沒有明確界定，但從《山本》的創作可以發現三類空間敘事創作手法的痕跡，即空間并置敘事、人物塑造的空間表征法以及空間敘事的另類表達——圖像敘事三種手法。通過結合文本對三種空間敘事的手法分析，利于進一步研究空間敘事在《山本》中呈現的狀況。

PCOS患者多存在糖脂代謝紊亂及高胰島素血癥。本實驗結果顯示，PCOS組大鼠血清FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C水平均明顯高于空白組，HDL-C水平明顯低于空白組，證實PCOS伴IR大鼠存在明顯高胰島素血癥和糖脂代謝紊亂；小檗堿組大鼠血清FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C水平均明顯低于PCOS組，說明小檗堿可明顯改善PCOS伴IR大鼠高胰島素血癥和糖脂代謝紊亂。

（2）凍融損害。凍融損害主要發生在寒冷地區的春融季節，路面結構中滯留的水在冬季環境溫度作用下凝固成冰，體積膨脹，影響瀝青路面的骨架結構以及瀝青與石料的黏附性，導致瀝青面層粒料的脫落，形成松散、麻面等病害。而當環境溫度升高時，結構層中的冰融化成水，在交通荷載的重復作用下，原有的病害擴展速度加劇，最終形成坑槽。

IR作為PCOS的代謝特征，可影響PCOS患者子宮內膜容受性[3]。IR可導致葡萄糖轉運蛋白表達水平降低，致使子宮內膜細胞葡萄糖供應不足，從而引起子宮內膜發育障礙[22]，而且IR引起的雄激素過多可以通過干擾葡萄糖代謝來抑制子宮內膜細胞的生長和活性，從而抑制蛻膜的分化[3]。本實驗結果顯示，POCS組大鼠子宮腔上皮細胞高度增加、肌層增厚和腺體擴張，提示胰島素聯合HCG造模的PCOS伴IR大鼠子宮組織具有增生趨勢；小檗堿組大鼠子宮腔上皮細胞高度降低，肌層變薄，未見腺體擴張，證明小檗堿可以改善PCOS伴IR大鼠子宮異常增生狀態。哺乳動物雷帕霉素(mTOR)是AMPK的下游靶標之一，參與細胞增殖，mTOR活性增加可導致子宮內膜增生[23]，AMPK的激活可以抑制mTOR通路，抑制子宮內膜細胞的增殖[24]。IRS是mTOR的下游成分，mTOR能夠磷酸化IRS蛋白在胰島素信號傳導途徑中的幾個殘基，從而影響胰島素信號傳導，mTOR被抑制后可以誘導IRS1表達，并消除PI3K/AKT/mTOR途徑的反饋抑制作用，激活AKT，降低細胞增殖活性[25]。故本研究認為小檗堿是通過AMPK途徑，抑制胰島素信號通路上的增殖基因mTOR，并激活上游胰島素信號通路，從而逆轉子宮形態異常增生。

研究發現PCOS患者的PI3K/AKT胰島素信號通路出現傳導障礙，GSK3β活性升高，AKT活性降低，糖原合成異常，胰島素對葡萄糖轉運作用下降，導致糖代謝障礙，出現IR[26]；而AKT的活性與GLUT4的表達有關，GLUT4低表達可影響子宮內膜營養供應[27]。本實驗結果顯示，PCOS組大鼠子宮組織中pIRS1-Ser307、GSK3β蛋白相對表達量均明顯升高，pAKT-S473蛋白和GLUT4 mRNA相對表達量明顯降低，提示子宮細胞糖代謝能力受損；與PCOS組比較，小檗堿組和二甲雙胍組大鼠子宮組織中pIRS1-Ser307、GSK3β蛋白相對表達量均明顯降低，pAKT-S473蛋白和GLUT4 mRNA相對表達量明顯升高，提示小檗堿可以調節IRS1/PI3K/AKT/GLUT4途徑，促進葡萄糖轉運，改善PCOS高胰島素血癥、IR及子宮內膜容受性。

綜上所述，小檗堿不僅能改善PCOS伴IR大鼠高胰島素血癥和糖脂代謝及生殖代謝紊亂，還可調節大鼠子宮胰島素信號通路IRS1、AKT、GSK3β和GLUT4的表達，改善子宮局部IR，從而改善子宮內膜容受性和子宮異常增生狀態。

3.朗讀課文。在課前，學生一般都不太明白該怎么學習語文，因此，可以通過預習，讓學生把課文讀熟，甚至能夠朗誦，從而使學生在進行課文朗誦時了解課文的內容，并對課文內容有所體會。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。