消癰乳康方通過調控JAK2/STAT3通路抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡、侵襲的作用機制研究

唐 眾，凌 潔，黃維芳

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410008)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1]。據世界衛生組織國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC )公布的2020年全球最新癌癥負擔數據顯示，全球乳腺癌新發病例高達226萬例，超過了肺癌的220萬例，乳腺癌取代肺癌成為全球第一大癌，同時每年超過68萬人死于乳腺癌[2-3]。目前針對乳腺癌的治療手段眾多，但多數治療手段具有不同程度的毒副作用，難以滿足乳腺癌患者的需求[4]。諸多研究表明，中醫藥治療乳腺癌存在多通路、多靶點的優勢，能夠有效改善臨床癥狀，延緩遠處轉移，延長生存期限，提高生活質量[5-6]。消癰乳康方是湖南中醫藥大學第一附屬醫院乳腺科臨床運用多年證實有效的治療乳腺疾病的驗方，該方用于治療乳腺癌有較好的臨床效果。本實驗從Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導子和轉錄激活子3(JAK2/STAT3)通路角度觀察了消癰乳康方對乳腺癌MCF-7細胞惡性腫瘤生物學行為的影響，以進一步探究消癰乳康方的作用機制，為中醫藥治療乳腺癌提供新思路與新方法。

1 實驗材料與方法

1.1實驗細胞 乳腺癌MCF-7細胞株，保存于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室(中國科學院細胞庫目錄號：TCHu 74)。

1.2實驗試劑及儀器 胎牛血清、1640細胞培養基、雙抗、0.25%胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司(生產批號：1640958，AD24221175，SV345103，SH30042)；培養瓶、離心管、巴氏管等一般消耗品購于美國NEST公司；細胞侵襲小室、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒購于美國Thermo公司(生產批號：TH269087，THB334077)；兔抗JAK2、兔抗磷酸化JAK2(p-JAK2)、兔抗STAT3、兔抗磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體均購于美國Proteintech公司；SYBR Green PCR檢測工具購于美國SantaCruz公司(FAST480Ⅱ型)。實驗儀器均為中南大學湘雅醫學院中心實驗室提供，倒置生物顯微鏡購于日本Olympus公司(OY34004型)；流式細胞儀購于美國BD公司，其余儀器均由實驗室提供。

1.3實驗藥物制備 消癰乳康方組方：郁金15 g、肉蓯蓉15 g、女貞子15 g、乳香10 g、沒藥10 g，中藥飲片購于湖南中醫藥大學杏林門診部藥房并經湖南中醫藥大學第一附屬醫院全國名中醫劉紹貴教授進行鑒定。將中藥飲片研磨成粉末，按一定比例煎煮濃縮后制成膏狀物，并按人臨床等效濃度配制成含原藥材2.88 g/mL。在使用前根據實驗要求的濃度以分析天平稱取消癰乳康方浸膏并置于PBS中，借助超聲震蕩儀進行震蕩處理30 min使其充分溶解，吸取其上清液并借助0.22 μm的濾膜完成雜質濾過，以棕色瓶避光儲存于4 ℃冰箱。在使用時以1640基礎培養基進行稀釋。

1.4細胞培養與分組 MCF-7細胞培養于含10%胎牛血清的1640培養基，培養箱環境設置為5% CO2、溫度37 ℃。將細胞分為4組：空白對照組以1640培養基進行干預，消癰乳康方高濃度組、消癰乳康方中濃度組、消癰乳康方低濃度組以16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL的消癰乳康方進行干預。

1.5檢測指標及方法

1.5.1CCK8法檢測細胞增殖情況 在培養箱環境中培養MCF-7細胞至對數生長期，離心后將其密度調整至1×107/mL。將細胞懸液200 μL種植至96孔板，并設置6個復孔進行觀察，靜置24 h以倒置顯微鏡觀察到MCF-7細胞完全貼壁后，消癰乳康方各濃度組加入相應濃度的消癰乳康方藥液分別干預24 h、48 h、72 h，運用CCK8法檢測細胞在490 nm波長處的光密度(OD)值。細胞抑制率=(1-OD值藥物組/OD值對照組)×100%。

1.5.2流式細胞法檢測細胞凋亡情況 在培養箱環境中培養MCF-7細胞至對數生長期，接種至無菌6孔板中。各組加入對應的培養基，干預24 h后離心收集細胞，置于0.1 mL的binding buffer中，將其密度調整至1×105/mL，PBS清洗后加入AnnxinV及PI染液(終質量濃度均為5 μg/mL)，孵育15 min后再次加入binding buffer，過濾后置于流式細胞儀檢測并計算各組細胞凋亡率。

1.5.3Transwell法檢測細胞侵襲能力 按照標準Transwell法檢測MCF-7細胞的侵襲能力，提前預冷試劑及操作器械，在4 ℃環境下將Matrigel基質膠均勻平鋪于Transwell小室并靜置30 min；空白培養基洗滌Transwell上室備用。在培養箱環境中培養MCF-7細胞處于對數生長期，離心后將其密度調整至5×105/mL；移液槍將細胞液懸液200 μL吸取至Transwell上室中，空白對照組添加1640培養基、消癰乳康方各濃度組添加相應濃度的消癰乳康方藥液繼續培養24 h；之后添加200 μL含15%的完全培養基至下室，置于5% CO2、溫度37 ℃的培養箱中進行培養，多聚甲醛固定10 min后以DAPI進行避光染色，之后隨機選取6個視野觀察拍照并計算穿膜細胞數。

1.5.4RT-PCR法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA表達 收集各組采用相應方法培養48 h后的MCF-7細胞，提取其總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性與純度,要求能夠清晰呈現28s、18s條帶,OD260 / OD280 比值介于1.8～2.0之間。取總RNA 20～50 μg,去除RNA基因組,按照試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，同時以β-actin作為內參基因并擴增。參照說明書設定PCR程序,95 ℃ 10 min變性,然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,重復40 個循環進行擴增。反應結束,設定最佳閾值,獲取Ct(threshold cycle)值，以相對定量2-ΔΔCt分析上述基因相對表達水平。

1.5.5Western blot法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達 收集各組采用相應方法培養48 h后的MCF-7細胞，提取相關蛋白，經凝膠電泳、轉印、洗膜、封閉等操作后添加JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗體(1∶2 000)，4 ℃環境靜置過夜。洗膜后添加對應二抗(1∶5 000)，室溫環境下靜置30 min后進行顯色操作，將β-actin作為內參蛋白，并在Quantity One軟件上進行分析。

2 結 果

2.1各組MCF-7細胞抑制率比較 消癰乳康方低、中、高濃度組處理MCF-7細胞24 h、48 h、72 h后細胞抑制率均明顯高于空白對照組(P均<0.05)，且消癰乳康方低、中、高濃度組細胞抑制率逐漸增高，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組乳腺癌MCF-7細胞抑制率比較

2.2各組MCF-7細胞形態 倒置顯微鏡下，空白對照組培養24 h后MCF-7細胞貼壁，生長良好，呈長梭形或多邊形，細胞個體飽滿，胞質豐富，輪廓清晰，呈簇狀聚集；消癰乳康方各濃度組均可見貼壁細胞數量明顯減少，呈散在排列，部分細胞體積改變，胞漿內出現空泡變性，細胞結構不完整，裂解成碎片，其中消癰乳康方高濃度組最為顯著。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下各組培養24 h后乳腺癌MCF-7細胞形態(×200)

2.3各組 MCF-7細胞凋亡率比較 培養24 h后，空白對照組和消癰乳康方低、中、高濃度組的MCF-7細胞總凋亡率(Q2+Q4)分別為(6.63±2.14)%、(20.06±3.25)%、(31.52±3.64)%、(38.21±4.02)%，消癰乳康方各濃度組均明顯高于空白對照組(P均<0.05)，且消癰乳康方低、中、高濃度組逐漸增高，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。流式細胞圖見圖2。

圖2 各組培養24 h后乳腺癌MCF-7細胞凋亡情況

2.4各組MCF-7細胞侵襲能力比較 培養24 h后，消癰乳康方低、中、高濃度組和空白對照組MCF-7細胞穿膜數分別為(86.46±4.65)個、(62.25±4.02)個、(36.57±3.45)個、(146.57±5.24)個，消癰乳康方各濃度組細胞穿膜數均明顯少于空白對照組(P均<0.05)，且消癰乳康方低、中、高濃度組細胞穿膜數逐漸減少，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 各組培養24 h后乳腺癌MCF-7細胞侵襲情況(×400)

2.5各組MCF-7細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA表達情況比較 培養48 h后，消癰乳康方低、中、高濃度組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA相對表達量均明顯低于空白對照組(P均<0.05)，且消癰乳康方低、中、高濃度組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA相對表達量逐漸降低，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組乳腺癌 MCF-7細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA相對表達量比較

2.6各組MCF-7細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達情況比較 培養48 h后，消癰乳康方低、中、高濃度組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白相對表達量均明顯低于空白對照組(P均<0.05)，且消癰乳康方低、中、高濃度組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白相對表達量逐漸降低，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖4及表3。

表3 各組乳腺癌MCF-7細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量比較

圖4 各組乳腺癌 MCF-7細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達情況

3 討 論

目前全球范圍內乳腺癌的發病率持續升高并呈年輕化態勢，極大程度上威脅了女性的生命與健康。

Sharma等[7]針對3 566名乳腺癌患者進行大數據調查結果顯示，乳腺癌較強的轉移侵襲的生物學特性是造成患者死亡的重要原因。目前早期乳腺癌主要采取手術治療，術后根據患者情況給予放化療、靶向治療等多途徑、多策略干預[8-9]，但多數治療手段存在程度不一的毒副反應，因此尋求高效、低毒副作用的治療方法勢在必行。中醫認為乳腺癌屬于“乳巖”“石乳”“石奶”等疾病范疇，其發病多為外邪侵襲、七情內傷導致沖任失調、氣滯血瘀、陽虛寒凝，日久遷延，則虛、寒、瘀、痰等病因及病理產物于乳房局部停滯形成乳腺癌[10-11]。消癰乳康方具有調攝沖任、活血化瘀、溫經散寒等功效，切合上述病機，但其作用機制尚不明確，故本實驗進行了相關探討。

乳腺癌的發病機制仍未完全明確，大多數研究認為其發生可能與女性基因缺陷、自身免疫因素、內分泌紊亂、生活作息、飲食或環境等因素相關[2]。近年來研究顯示，JAK2/STAT3信號通路可能在乳腺癌的發生發展進程中扮演著極為重要的角色[12]。Ding等[13]研究顯示，JAK2/STAT3信號傳導通路能夠介由對下游各類影響因子及效應分子進行活化，進而對乳腺癌細胞的增殖、凋亡以及細胞周期進行調控，是乳腺癌細胞產生侵襲轉移生物學特性的重要信號通路之一。STAT3基因被認為是多種惡性腫瘤的關鍵靶點，JAK2/STAT3信號通路是STAT3基因信號轉導以及轉錄激活的關鍵信號通路。Zhang等[14]研究表明，在乳腺癌的發生發展過程中，往往伴隨著JAK基因與STAT基因的非正常表達及異?；钴S，特別是在乳腺癌的侵襲轉移階段，JAK2/STAT3信號通路多處于穩定的活化狀態。JAK2/STAT3信號傳導通路中的關鍵基因JAK2、STAT3能夠調控G1/S-特異性周期蛋白-D1(cyclinD1)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)以及促凋亡基因Bax等腫瘤細胞關鍵調控蛋白的表達，參與惡性腫瘤細胞凋亡、增殖以及侵襲轉移等多個惡性生物學進程，與乳腺癌的生長、轉移、侵襲息息相關[15]。Nafie等[16]研究表明，乳腺癌細胞的增殖過程中JAK2/STAT3信號通路可明顯上調Bcl-2以及cyclinD1的蛋白表達，通過藥物抑制JAK2/STAT3信號通路能夠有效促進乳腺癌細胞凋亡，抑制乳腺癌細胞增殖。Zhang等[17]研究顯示，JAK2/STAT3信號通路的異?；罨芮袇⑴c了乳腺癌細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移及腫瘤小血管生成等。Noori等[18]認為JAK2/STAT3信號通路是乳腺癌新藥開發的最熱門靶點信號通路之一。

本實驗結果顯示，消癰乳康方各濃度組MCF-7細胞抑制率和凋亡率均明顯高于空白對照組，細胞穿膜數均明顯少于空白對照組，JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA和蛋白相對表達量均明顯低于空白對照組，并表現出濃度依賴性。提示消癰乳康方可有效抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖、侵襲，促進細胞凋亡，機制可能與其抑制JAK2/STAT3信號通路激活有關。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。