丹參酮調控LncRNA DLX6-AS1對LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷的作用*

余淑菁 余莉萍 李旭成 崔金濤

（1.湖北省武漢市優撫醫院，湖北 武漢 430021；2.湖北省武漢市中醫醫院，湖北 武漢 430014）

急性肺損傷發病機制較為復雜，目前尚無有效的治療手段［1-2］。肺泡Ⅱ型上皮細胞位于肺泡表面并可抵御外界病原體，肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡及炎癥反應等可造成細胞損傷從而促進急性肺損傷的發生［3］。研究表明中醫藥成分具有減輕急性肺損傷作用，但關于其具體作用機制尚未闡明［4］。丹參酮（又稱丹參酮ⅡA）是從唇形科植物丹參中提取的一種脂溶性非醌色素類化合物，研究表明丹參酮可抑制心肌細胞氧化應激從而減輕心肌細胞損傷［5］。但丹參酮與急性肺損傷相關研究報道相對較少。研究表明，LncRNA DLX6-AS1在脂多糖（LPS）誘導的人腎小管上皮細胞中表達上調，降低其表達可抑制細胞凋亡從而減輕急性腎損傷［6］。但DLX6-AS1在急性肺損傷中的作用機制尚未闡明。因此，本研究采用LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞建立急性肺損傷模型，探討丹參酮是否可通過調控DLX6-AS1表達而影響LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 丹參酮（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；LPS購自美國Sigma；Trizol試劑、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen；MTT試劑、細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶；白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒購自上海酶聯生物；反轉錄與熒光定量PCR試劑購自美國Thermo Fisher；si-NC、si-DLX6-AS1、pcDNA、pcDNA-DLX6-AS1購自上海吉瑪制藥。

1.2 細胞株 肺泡Ⅱ型上皮細胞，購自無錫菩禾生物醫藥技術有限公司。

1.3 分組與干預 肺泡Ⅱ型上皮細胞常規培養，待細胞生長至80%融合度時進行傳代培養。取對數生長期細胞按 1×104個/孔接種于 6孔板，加入含 5 μg/mL LPS的DMEM培養基處理24 h［7］，記為LPS組。同時將正常培養細胞記為空白對照組。用不同質量濃度（5、10、20 μg/L）的丹參酮［8］與含5 μg/mL LPS的DMEM培養基處理24 h，分別記為LPS+丹參酮L組、LPS+丹參酮M組、LPS+丹參酮H組。采用脂質體轉染法將si-NC、si-DLX6-AS1分別轉染至肺泡Ⅱ型上皮細胞，轉染成功后加入含有5 μg/mL LPS的DMEM培養基培養24 h，分別記為LPS+si-NC組、LPS+si-DLX6-AS1組。采用脂質體轉染法將pcDNA-DLX6-AS1轉染至肺泡Ⅱ型上皮細胞，轉染成功后加入含有20 μg/L丹參酮與 5 μg/mL LPS的DMEM培養基培養24 h，記為LPS+丹參酮+pcDNA-DLX6-AS1組。

1.4 MTT檢測細胞增殖 將各組肺泡Ⅱ型上皮細胞以2×103個/孔接種于96孔板，每孔添加20 μL的MTT溶液，孵育4 h后，每孔添加150 μL DMSO，避光振蕩孵育5 min。酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度（A）值。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 胰蛋白酶消化各組肺泡Ⅱ型上皮細胞，按照凋亡檢測試劑盒進行雙染色，用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.6 ELISA法檢測IL-6、IL-10、TNF-α的水平 肺泡Ⅱ型上皮細胞按照分組處理后，收集培養液上清，參照ELISA試劑盒步驟測定IL-6、IL-10、TNF-α的水平。

1.7 qRT-PCR檢測DLX6-AS1的表達水平 取1 mL Trizol試劑q

1.8 統計學處理 應用SPSS21.0統計軟件。計量資料以（）表示，兩組間計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間計量資料的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷及炎癥因子的比較 見圖1，表1。與空白對照組比較，LPS組細胞增殖抑制率和細胞凋亡率升高（P＜0.05），IL-6、TNF-α、IL-10的水平升高（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS+丹參酮L組、LPS+丹參酮M組、LPS+丹參酮H組細胞增殖抑制率和細胞凋亡率降低（P＜0.05），IL-6、IL-10、TNF-α的水平降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表1 各組肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷及炎癥因子的比較（±s）

表1 各組肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷及炎癥因子的比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與LPS+丹參酮L組比較，△P＜0.05；與LPS+丹參酮M組比較，□P＜0.05。下同。

組 別n 抑制率（%） 凋亡率（%）IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）TNF-α（pg/mL）空白對照組LPS組LPS+丹參酮L組LPS+丹參酮M組LPS+丹參酮H組3 3 3 3 3 0.00±0.00 58.27±3.37*49.98±2.43#38.41±1.54#△21.98±1.21#△□7.72±0.61 23.67±1.81*20.24±1.09#16.46±0.96#△11.25±0.64#△□55.35±5.36 307.13±15.42*254.17±17.67#173.22±8.61#△119.88±13.31#△□101.92±12.13 350.89±18.91*304.42±13.11#237.74±10.84#△180.84±14.10#△□22.49±2.32 166.55±15.30*120.32±12.60#91.33±5.17#△58.90±6.78#△□

2.2 各組肺泡Ⅱ型上皮細胞中DLX6-AS1表達的比較 見表2。與空白對照組比較，LPS組DLX6-AS1的表達量升高（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS+丹參酮H組、LPS+丹參酮L組、LPS+丹參酮M組DLX6-AS1的表達量降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表2 各組肺泡Ⅱ型上皮細胞中DLX6-AS1表達的比較（±s）

表2 各組肺泡Ⅱ型上皮細胞中DLX6-AS1表達的比較（±s）

組別空白對照組LPS組LPS+丹參酮L組LPS+丹參酮M組LPS+丹參酮H組n33333 DLX6-AS1 1.00±0.00 4.00±0.11*3.35±0.07#2.53±0.07#△1.78±0.11#△□

2.3 各組DLX6-AS1轉染后DLX6-AS1轉染效率的檢測 見表3。與si-NC組比較，si-DLX6-AS1組DLX6-AS1的表達量降低（P＜0.05）；與pcDNA組比較，pcDNA-DLX6-AS1組DLX6-AS1的表達量升高（P＜0.05）。

表3 各組DLX6-AS1表達的檢測（±s）

表3 各組DLX6-AS1表達的檢測（±s）

注：與si-NC組相比，*P＜0.05；與pcDNA組相比，#P＜0.05。

組別si-NC組si-DLX6-AS1組pcDNA組pcDNA-DLX6-AS1組n 3333 DLX6-AS1 1.00±0.00 0.37±0.04*1.00±0.00 3.68±0.09#

2.4 各組肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷及炎癥因子的比較 見圖2，表4。與LPS組、LPS+si-NC組比較，LPS+si-DLX6-AS1組細胞增殖抑制率和細胞凋亡率降低（P＜0.05），IL-6、IL-10、TNF-α的水平降低（P＜0.05）。

表4 沉默DLX6-AS1對肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷及炎癥因子的影響（±s）

表4 沉默DLX6-AS1對肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷及炎癥因子的影響（±s）

注：與LPS組比較，*P＜0.05；與LPS+si-NC組比較，#P＜0.05。

組別LPS組LPS+si-NC組LPS+si-DLX6-AS組n 3 3 3抑制率（%）58.35±3.64 58.38±3.77 15.49±1.06*#凋亡率（%）23.77±1.97 23.88±2.07 9.76±0.58*#IL-6（pg/mL）307.98±16.99 306.10±18.78 84.34±6.74*#IL-10（pg/mL）352.56±23.45 353.40±25.97 141.39±11.25*#TNF-α（pg/mL）164.50±18.65 161.08±16.92 38.28±3.46*#

2.5 過表達DLX6-AS1對丹參酮處理的LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷及炎癥因子的影響 見圖3，表5。與LPS+丹參酮組比較，LPS+丹參酮+pcDNADLX6-AS1組細胞增殖抑制率和細胞凋亡率升高（P＜0.05），IL-6、IL-10、TNF-α的水平升高（P＜0.05）。

表5 過表達DLX6-AS1可逆轉丹參酮對LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷及炎癥因子的影響（±s）

表5 過表達DLX6-AS1可逆轉丹參酮對LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷及炎癥因子的影響（±s）

注：與LPS組比較，*P＜0.05；與LPS+丹參酮組比較，#P＜0.05。

組別LPS組LPS+丹參酮L組LPS+丹參酮+pcDNA-DLX6-AS1組TNF-α（pg/mL）161.11±20.19 58.14±7.94*138.41±9.00#n 3 3 3抑制率（%）58.49±3.91 22.10±1.21*51.52±4.44#凋亡率（%）23.75±1.97 11.15±0.87*21.05±1.27#IL-6（pg/mL）312.88±16.33 118.22±12.90*270.67±14.55#IL-10（pg/mL）349.21±33.38 178.67±18.22*311.01±24.80#

3 討 論

據研究，丹參酮可促進心肌細胞增殖及抑制細胞凋亡從而減輕心肌細胞損傷［9］，可抑制炎癥反應從而減輕腦微血管內皮細胞炎性損傷［10］，也可抑制β淀粉樣蛋白誘導的腦微血管內皮細胞氧化應激從而減輕細胞損傷［11］。本研究結果顯示，LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞增殖抑制率和細胞凋亡率升高，TNF-α、IL-6、IL-10水平升高，與已有研究結果相似［12］，提示成功建立急性肺損傷模型。本研究進一步分析發現，隨著丹參酮濃度的升高，LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞增殖抑制率和細胞凋亡率降低，并可降低IL-6、IL-10、TNF-α的水平。

沉默DLX6-AS1可減輕腦缺血/再灌注損傷［13］。DLX6-AS1在肝癌［14］、喉癌［15］中表達上調。本研究結果顯示，LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞中DLX6-AS1的表達量升高，丹參酮處理后LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞中DLX6-AS1的表達量降低，提示丹參酮可能通過抑制DLX6-AS1表達而減輕急性肺損傷。同時本研究結果顯示DLX6-AS1過表達可減弱丹參酮對LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡及炎癥反應，并降低LPS對肺泡Ⅱ型上皮細胞的增殖抑制作用。

綜上所述，丹參酮可通過下調DLX6-AS1表達來抑制LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡、炎癥反應，促進細胞凋亡。DLX6-AS1可能作為丹參酮治療急性肺損傷的潛在靶點。