水產養殖環境中抗生素與重金屬耐藥共選擇機制研究

謝家瑩，江夢琪，張紅敏,2,#，潘迎捷,2,3，劉海泉,2,3，謝慶超,2,#，趙勇,2,3,*

1. 上海海洋大學食品學院，上海 201306 2. 農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海 201306 3. 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306

為了預防水產動物病害，抗生素在集約化水產養殖過程中被普遍施用。養殖規模的增大也導致水產品中細菌性疾病尤其是在密集型的水產養殖體系中的發病率極高，由此導致了抗生素的過量使用，大部分抗生素流入河流湖泊等水體，最終匯入到中國近海。有研究表明，人類社會中大量使用抗生素和耐藥菌的頻繁出現之間存在明顯的聯系[1]，例如隨著抗結核桿菌藥物的不斷增多，耐藥結核菌在世界范圍內廣泛傳播[2]。長期在飼料中添加抗生素會導致養殖水產品體內誘導產生抗性菌株及抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)。水產養殖環境已經是世界公認的ARGs儲存庫，水環境壓力是一個特殊的環境特征，抗生素會隨著水流流向各地，極大地促進ARGs的水平基因轉移和物質交換。相比于環境中殘留的抗生素，環境中ARGs的持續殘留、菌群間的轉移傳播更會加重生態環境的污染。2013—2018年，我國22種常用的主要抗生素原料藥產量維持在18～20萬t，一半以上用于獸用飼料[3]。2019年，世界衛生組織將抗生素耐藥性列為全球衛生十大威脅之一[4]，并且預測，除非抗生素研究取得進展，否則到2050年，耐藥性感染可能導致全球多達1 000萬人死亡[5]。除了抗生素，重金屬也具有抗菌特性，它們的抗菌效果使它們可以像抗生素一樣發揮作用。因此，這些重金屬元素也可能在選擇耐藥細菌中發揮直接或間接作用而導致類似的耐藥問題。水產養殖環境中大量投放含重金屬的促生長劑和殺菌劑已經導致大面積的水體污染，我國有研究人員調查了遼東灣[6]、北黃海[7]、杭州灣[8]和北部灣[9]水體重金屬污染狀況，分別發現鉛、鎘和汞等重金屬含量超標嚴重。重金屬具有高毒性、不可降解、易于生物積累等問題。沉積物是水體中重金屬的主要存儲介質，水環境中的重金屬通過吸附和積累懸浮的細粒度顆粒而轉移并聚集在沉積物中，造成嚴重污染。同時，重金屬與抗生素也會產生復合耐藥機制，驅動ARGs的產生和傳播[10]。

基于此，本文介紹了水產養殖環境中重金屬和抗生素的污染現狀，比較了不同來源養殖水中ARGs的賦存情況，并且詳細介紹了重金屬對抗生素活性和細菌耐藥性的影響，討論了重金屬和抗生素在這一過程中的一些潛在的共選擇機制，以便更好地了解和評價水產養殖環境中ARGs的存在和散布風險。

1 水產養殖環境中抗生素、ARGs及重金屬污染現狀(Current situation of antibiotics, ARGs and heavy metals pollution in aquaculture environment)

抗生素是用于人類治療的最成功的藥物之一，由于它們可以抑制微生物種群生長，也被視為重要的污染物。除了用于人類治療外，抗生素還廣泛用于農林畜牧業和水產養殖業[11]。在漁業養殖過程中常使用的抗生素主要有五大類：磺胺類、四環素類、喹諾酮類、大環內脂類和β-內酰胺類藥物[12]?？股卦谧匀画h境中釋放的最明顯的后果是耐藥菌的出現[13]和抗性基因的傳播，對于后者鑒于它們不是“可降解的污染物”，而是自動復制的元素，因此污染情況更為復雜。Chen等[14]調查了我國13個東南沿海養殖地區的抗生素、抗性基因污染現狀及風險，結果顯示海水和沉積物中存在11種常用抗生素和9種ARGs，其中磺胺類含量水平最高。有學者在西北地區最大的鱘魚養殖場內陸湖瀛湖中檢出8類共59種ARGs，并且養殖水域的ARGs相對豐度遠高于上游非養殖型水域[15]。國內外研究發現，ARGs在全球范圍內的水產品中廣泛存在，由早期的四環素(TC)抗性基因(tetD、tetB、tetA、tetG)和氯霉素(CHL)抗性基因(catIV、catII)[16-18]，到后期的的喹諾酮(CIP)類(qnrS5)和萬古霉素(VAN)抗性基因(vanB)[19-20]，ARGs種類不斷增加，污染程度逐漸加重。表1統計了幾個地區水產養殖環境中ARGs的污染情況，結果顯示ARGs已具有一定的復雜性，不同地區ARGs賦存情況有很大差異且與水產品中ARGs息息相關。

表1 水產養殖環境沉積物、生物體及水體中抗生素抗性基因(ARGs)賦存情況Table 1 Occurrence of antibiotic resistance genes (ARGs) in sediments, organisms and water bodies in aquaculture environment

和抗生素一樣，重金屬也廣泛存在于不同生態系統中。且其化學性質穩定，不易降解，一些細菌可能因為重金屬的毒性而死亡，同時有些細菌能夠對重金屬毒性產生耐受，并能夠穩定遺傳。它擾亂細菌生長代謝，激活菌體金屬保護應激反應和生長狀態，也可導致細菌對抗生素的耐藥性。水產養殖水中的重金屬主要由外源性污水引入以及內源性養殖方式引入兩部分組成。外源性污水主要包括生活污水和工業污水兩部分，動物糞便、農業徑流或采礦副產品沉積物污染的土壤，都會隨污水排入水產養殖區。內源性養殖方式引入方面，盡管抗生素制劑已經被用于養殖業，抗菌金屬銅(Cu)、鋅(Zn)、鎘(Cd)和砷(As)等和其他無機化合物也依然在用于治療水產動植物疾病。以海水養殖為例：2019年我國海水養殖產量為2 065.33萬t，占全部養殖水產品產量的40.7%。其中大部分為灘涂或近海養殖[27]。而僅在2019年我國共向近海排放污水中就含六價鉻(Cr6+)(2 217.3 kg)、鉛(Pb2+)(6 910.5 kg)、汞(Hg2+)(270.2 kg)、鎘(Cd2+)(339.2 kg)。其中，Cr6+、Pb2+在黃海海域排放最多，Hg2+在東海海域排放最多，Cd2+在南海海域排放最多。雖然測試結果受季節等因素變換有些許變化浮動，但也能部分反映這些海域重金屬污染狀況。重金屬超標情況也在各個國家水產養殖領域中引起了極大的關注，例如，孟加拉國西南部沿海地區人工養殖蝦池水和沉積物中總砷(總As)和硒(Se4+)檢出濃度較高[28]，而位于埃及的養殖水樣中Cd2+、Cu2+和Zn2+重金屬嚴重超標[29]。針對我國幾個主要沿海地區水產品中重金屬含量超標檢出率情況的研究中[30-36]，發現不同區域超標的重金屬種類不同，Cr6+在廣東沿海檢出率較高，總As在杭州灣和渤海地區檢出率較高，Pb2+在吉林和廣東檢出率較高，Cd2+則在吉林、山東和福建沿海檢出率較高。有學者以山東、江蘇、安徽、浙江、上海和福建等地區養殖池塘作為研究對象，發現有近一半的養殖池塘樣點Cu2+和Pb2+超出我國國家標準，并且Cd2+污染最為嚴重，嚴重超出國家標準[37]。還有研究發現池塘養殖水Cu2+、Zn2+含量不僅存在安全風險，還會隨著養殖時間的增加而增高[38]。

2 水產養殖環境中重金屬對抗生素活性的影響(The effect of heavy metals on the activity of antibiotics in aquaculture environment)

重金屬離子與有機物中含硫、氮和氧官能團的高親和力結合會導致有機物的失活和損傷。大多數抗生素含有富電子基團，當其與重金屬離子共存時，可作為電子供體與金屬離子絡合形成絡合物，這可能會阻礙或增強抗生素的活性。重金屬和抗生素絡合形成的復雜化合物和疊加效應可能會影響水生環境中的生物。CIP[39]和四環素類[40](TCs)，氯四環素(CTC)和氧四環素(OTC)抗生素含有羧基、碳基或哌嗪基(圖1)。它們充當潛在的電子供體來協調金屬。這些配體抗生素可以通過絡合物結合多種金屬。這種相互作用雖然減少了環境中抗生素和重金屬的總量，但形成了被認為是新興污染物的復合物?？股睾椭亟饘俚膹秃衔锝洺３霈F在天然水中被檢測到[41]。

圖1 不同抗生素與重金屬的常見絡合位點(紅色基團)注：TC表示四環素，OTC表示氧四環素，CIP表示環丙沙星。Fig. 1 Common complexing sites of different antibiotics and heavy metals (red group)Note: TC is tetracycline, OTC is oxytetracycline, and CIP is ciprofloxacin.

重金屬和抗生素形成的絡合物一般有1∶1、1∶2和1∶3共3種。一些重金屬很容易與CIP和OTC[42]形成穩定的絡合物。Zn2+可以與VAN[43]、CIP[44]以及β-內酰胺類[45]抗生素結合并且促進其水解失活。金屬離子和抗生素形成的絡合物一般和抗生素官能團，金屬離子類型和含量以及水環境的影響有關。Cu2+和Al3+都能形成與TC的絡合物，并且當Cu/TC物質的量比增加到1以上時，TC與Cu2+的絡合位點將由BCD環轉變為A環[46]。Zn2+還可以與VAN形成絡合物，降低環境中Zn2+含量。Brillault等[47]測定了CIP與金屬離子的表觀，金屬得電子能力順序與金屬的絡合能力基本一致[48]。其中，Zn2+和Al3+的不一致可能與其離子半徑有關，由于兩者的得電子能力相差不大，而Al3+較小的半徑減少了其絡合時的空間位阻，導致其具有更大絡合能力。除此之外，在不同pH的水環境條件下，Cu2+可與CIP形成不同的絡合物。這些絡合物通常比單獨的金屬離子或抗生素具有更高的毒性，對藻類的生長有更強的抑制作用，例如Cu2+和CTC的共存[49]就可以形成對蛋白核小球藻有毒性的復合體。

除了絡合作用外，重金屬作為有毒實體，也可以幫助抗生素殺死細菌，抗生素和重金屬的疊加效應也對水環境中的生物產生影響。此外，金屬的存在增加了喹諾酮和四環素抗生素與RNA靶點的親和力，從而提高抗生素活性[50]。OTC和Cu2+的同時存在[51]對土壤微生物群落的功能多樣性有顯著的負面影響。當Pb2+與磺胺類抗生素共存時，對發光菌的急性毒性急劇上升[52]。全霉素顯示強烈的鋅依賴活性，只有在Zn2+存在的環境中才能發揮最大作用[53]。另外，Zn2+與妥布霉素(TO)、頭孢他啶(CAZ)或CIP這3種抗生素共存時，可以增強抗生素的抗菌作用[54]。因此，雖然環境中的重金屬可以對抗生素的活性和細菌對抗生素的敏感性產生不利的影響，但同時這些金屬也可以對抗生素產生協同增效的作用。

3 水產養殖環境中重金屬對細菌耐藥性的影響(The effect of heavy metals on bacterial antibiotic resistance in aquaculture environment)

低濃度的金屬陽離子作為某些金屬蛋白的必需成分，雖然對正常細菌細胞功能至關重要，但在高水平時是有毒的。甚至，在更高的水平上，這些金屬為耐藥性提供了選擇壓力，這反過來又會由于金屬之間的遺傳和生理聯系而驅動對抗生素的耐藥性。關于重金屬及其耐藥性產生的情況在某些方面與抗生素污染相似[55]。此外，對有毒重金屬和金屬類物質的抗性基因(metal resistance genes, MRGs)也被認為是很古老的[56]。

重金屬與環境細菌中抗生素耐藥性的發展密切相關。許多研究表明環境中重金屬的存在，會導致ARGs和耐藥菌的豐度增加。Zhang等[57]的研究表明，0.2～1 mg·L-1三價砷作用6 h后，耐藥菌即可快速實現共選擇，同時耐藥基因和可移動遺傳元件(mobile genetic elements, MGEs)的相對豐度增加。Zhou等[58]通過對廣東省3個鴨魚養殖場的土壤、水和沉積物樣本進行分析，發現Cu2+和Zn2+與多種ARGs類型有顯著相關性，并證明了Cu2+和Zn2+與特定的ARGs的豐度呈現正相關。Li等[59]通過試驗表明，重金屬富集對微生物群落、ARGs和MRGs有顯著影響。重金屬也可以促進抗性質粒的水平轉移而促進ARGs擴散，Lu等[60]通過實驗證明，Ag+促進了質粒攜帶的ARGs在細菌屬間的偶聯轉移，并且在濃度為1 μg·L-1和10 μg·L-1時的轉移頻率最大，不是完全的正相關關系。Devarajan等[61]在日內瓦湖不同地區的沉積物剖面中，使用定量PCR對樣品中ARGs(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaNDM和aadA)進行鑒定同時發現糞便指示菌和假單胞菌屬等指示細菌的豐度與沉積物中有機物和金屬濃度密切相關，并且在湖泊富營養化后受污水處理廠污染的沉積物中，鑒定出豐富的ARGs。也有研究表明，即使環境中不含抗生素，依然存在ARGs的產生和轉移，這與重金屬有著密切聯系[62]，這也可以解釋細菌耐藥表型與基因型大部分情況下不對應的現象。此外，由重金屬促進的細菌總生理狀態的變化而導致抗生素耐藥性的現象也已被發現。如圖2所示，生物膜是將細菌嵌入在聚合物基質中表面的附著結構，細菌產生生物膜后會引起對抗生素抗性的增強[63]，例如Cd2+可以增加鏈球菌生物膜形成能力，從而增強耐藥性[64]。此外，雙組分信號系統是一種跨膜信號轉導系統，與多種細菌耐藥性的形成密切相關[65]。在重金屬刺激下，它可以通過介導細菌體內各種生理途徑適應環境、感應體內外變化，從而在調控細菌耐藥方面發揮重要作用[66]。

圖2 雙組分系統和生物膜示意圖Fig. 2 Schematic diagram of two-component system and biofilm

總之，環境中的重金屬是常見的細菌應激源，它們為環境菌株的抗生素耐藥性提供選擇性壓力。并且，重金屬脅迫會以多種方式影響基因表達和細菌細胞生理結構，從而增強抗生素耐藥性。嚴重的水體污染讓水產品逐漸成為ARGs的儲存庫和傳播擴散的載體，以至于嚴重威脅了人類健康以及妨礙了相關疾病的治療。同樣，有機體存在的環境反過來也可以影響抗生素的活性和細菌對抗生素的敏感性，了解環境因素的影響也是預測生物體內抗生素效果的關鍵。水環境由于其促進適應性和保護反應，通過改變細菌細胞生理條件也會影響細菌對抗生素的敏感性[67]。已經有研究表明，營養物質、重金屬和細菌群落都可能直接或間接地促進了海水養殖區中ARGs的傳播[68]。

4 水產養殖環境中重金屬與抗生素耐藥性的共選擇(Co-selection of resistance to heavy metals and antibiotics in aquaculture environment)

細菌產生耐藥性的方式主要有固有抗性和獲得抗性2種。固有抗性是指細菌本身就對抗生素具有一定的抗性，其染色體上含有抗性基因，并可以在親子代之間進行遺傳。獲得抗性是指細菌本身對某些抗生素敏感，但是經過某些環境因素的選擇，使細菌獲得了含ARGs的質粒等MGEs，或者直接誘導了基因突變、沉默基因表達，從而導致該菌在外形結構和生理、生化等方面發生了變化。同樣重金屬耐藥性是許多暴露于金屬環境中的微生物的常見表型。重金屬污染的類型和水平與抗生素耐藥性的特定模式之間的聯系表明，這種共同選擇過程背后有多種機制。這些共選擇機制基本分為3種：協同抗性、交叉抗性和協同調控[69]，如圖3所示[70]。

隨著網絡流量不斷增大，網絡攻擊也相應增加，特別是 DDoS 攻擊事件越來越成為困擾企業和電信運營商的網絡安全事件，它對企業正常運營帶來很大的影響。拒絕服務即 DoS（Denial of Service），造成 DoS的攻擊行為被稱為 DoS 攻擊，由于攻擊簡單、容易達到目的、難于防止和追查，逐漸成為常見的攻擊方式，其目的是使計算機或網絡無法提供正常的服務。DDoS（Distributed Denial of Service）指借助于客戶/服務器技術，將多個計算機聯合起來作為攻擊平臺，對一個或多個目標發動 DoS 攻擊，從而成倍地提高拒絕服務攻擊的威力。

圖3 重金屬和抗生素耐藥的共選擇機制[70]注：MRG表示金屬類物質抗性基因，ARG表示抗生素抗性基因。Fig. 3 Co-selection mechanism of heavy metal and antibiotic resistance[70]Note: MRG represents metal resistance genes, and ARG represents antibiotic resistance genes.

協同抗性，是多個不同的抗性基因位于同一遺傳元件上。在重金屬和抗生素污染的環境中耐藥菌的富集是通過選擇在染色體或質粒上攜帶的MRGs和ARGs高表達來實現的。黃河底泥中得到的金黃色葡萄球菌，有一存在于質粒上的emrA/B基因同時對氨芐西林(AMP)和Cr6+具有抗性[71]。Hasman和Aarestrup[72]在屎腸桿菌(E.faecium)的同一質粒中發現，Cu2+抗性基因tcrB與編碼大環內酯類(erm(B)和糖肽(vanA)的抗性基因相連。同樣，對質粒和細菌基因組序列數據庫的詳細分析揭示了許多MRGs和ARGs共存于一個MGEs上或物理連接在染色體上的實例(表2)。除了質粒之外，其他MGEs，例如整合子和噬菌體[73]也會同時攜帶MRGs和ARGs。di Cesare等[74]在3個污水處理廠中進行了研究調查，發現了1類整合子與重金屬抗性基因和抗生素抗性基因的豐度相關。

表2 細菌中金屬和抗生素耐藥性的協同抗性Table 2 Co-resistance of metal and antibiotic resistance in bacteria

當一個遺傳決定因素能夠同時導致抗生素和重金屬耐藥性時，就會發生交叉耐藥性。例如，tetL、merE和oprD基因對重金屬和抗生素同時有耐藥性。外排泵系統是常見的交叉抗性系統，但目前除外排泵之外，關于交叉抗性的研究還較少。

協同調控被定義為對細菌對重金屬和抗生素暴露形成協調的反應，細菌通過轉錄翻譯等協同調控機制調控ARGs的表達，同時增強菌株的耐藥性。Cao等[75]為了驗證重金屬和抗生素的共同抗性機制比較了在As3+脅迫和非As3+脅迫下的細菌細胞的轉錄活性。結果顯示，在As3+脅迫下，抗生素抗性基因arsD、arsB、arsA和arsC等均有所上調。這些結果表明抗生素抗性基因和抗生素可以被As3+共調控。Berg等[76]研究發現耐銅分離株對CHL和TC的耐藥率明顯較高。Jo等[77]研究發現，經過重金屬(Co2+和Cu2+)預處理后，有7個菌株對卡那霉素(K)、鏈霉素(S)、TC和慶大霉素(CN)的抗性增強。顯然，抗生素和重金屬之間存在一個復雜的動態過程。

5 總結與展望(Summary and perspective)

在水產養殖環境中，有機和無機成分的復合污染是普遍共存的。目前抗生素與重金屬復合污染問題日益嚴重，人們對復合污染逐漸重視，然而現在的大多數調查仍然停留在相關污染的研究調查階段及抗性基因的定性定量分析階段，目前關于兩者的復合污染對細菌耐藥的影響及防控研究并不多，需要更多的研究來評估復合污染物對環境中ARGs增殖和傳播的影響。例如，目前大多數研究采用的重金屬和抗生素濃度均為亞致死濃度和最小抑菌濃度，而抗生素和重金屬脅迫濃度持續增加對于ARGs增殖和傳播的影響則鮮有研究。另外，其他有毒物質也可能與抗生素耐藥性的共同選擇和傳播有關，這進一步模糊了重金屬的作用，因此，需要對金屬和抗生素之間復雜的相互關系進行詳細的研究，更好地解釋復合污染的污染特性和污染機理，以便對抗生素耐藥性的持續和擴散有一個連貫和嚴格的理解。此外，目前對于重金屬與抗生素污染物的去除有較多的研究，而復合污染形成的絡合物研究較少，復合污染物的處理比單一化學污染物的處理更為困難，未來還應進一步開展針對絡合物去除技術的研究，挖掘不同技術對抗生素和重金屬復合污染去除的綜合手段。