淋巴結活檢組織EBER原位雜交檢測條件優化探討

肖玉嬌，李三恩，朱衛東，石晨曦

（1.山西省晉城市人民醫院病理科，山西 晉城 048000；2.蘇州大學附屬第一醫院病理科，江蘇 蘇州 215006）

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）屬皰疹科病毒，是一種人類特異性嗜淋巴細胞性皰疹病毒[1]。已有研究[2]表明多種淋巴瘤的發生、發展過程與EBV感染密切相關，包括彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、霍奇金淋巴瘤（HL）、NK/T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤等。EBV相關淋巴組織疾病診斷相對困難，原位雜交檢測腫瘤細胞中EBV編碼的小RNA（EBV encoded RNA,EBER）是診斷腫瘤是否EBV相關的重要手段[3]。淋巴結活檢樣本常常是初次確診樣本或治療后評估確診樣本，是診斷和療效評價的“金標準”，因此探究最適宜的檢測條件至關重要。本研究從切片厚度、胃蛋白酶消化時間、雜交時間三方面對淋巴結活檢組織設置梯度檢測，探究最適宜檢測條件。

1 材料與方法

1.1 材料 選取蘇州大學附屬第一醫院2019年—2020年EBER陽性相關病例11 例，標本類型為淋巴結活檢組織，其中NK/T淋巴瘤3 例，血管免疫母細胞性淋巴瘤1 例，HL 3 例，DLBCL 4 例。所有標本均經規范取材并用10%中性福爾馬林固定。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：EBER檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，主要試劑包括：胃酶工作液，HRP標記抗地高辛抗體，DAB底物緩沖液，DAB濃縮顯色液，PBS緩沖液粉末pH7.3，Tween-20，地高辛標記的EBER探針；其他試劑：脫蠟液、乙醇（無水、95%、75%）、去離子水、橡膠水泥、中性樹膠、蘇木素染色液等。

1.2.2 儀器：切片機（LEICA RM2235），電熱恒溫箱等。

1.3 方法 EBER原位雜交檢測，試劑盒推薦步驟如下：切片脫蠟至置于無水乙醇中，浸泡3 min×3次，空氣干燥5 min；每張切片滴加足夠量的胃酶工作液，37 ℃孵箱孵育5～30 min；棄去胃酶工作液，梯度乙醇脫水（75%，95%，100%各2 min），空氣干燥；切片滴加5～10 μL地高辛標記的EBER探針，加硅化蓋玻片，橡膠水泥封邊，37 ℃雜交孵育2～4 h或過夜（孵育盒內保濕）；PBS緩沖液洗去蓋玻片；PBS緩沖液洗2 min×3 次；滴加30～50 μL HRP標記抗地高辛抗體，37 ℃孵育30 min；PBS緩沖液沖洗2 min×3 次，暗處DAB顯色5～10 min；蒸餾水沖洗，蘇木精復染5～10 s；分化、沖洗反藍；乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。每次雜交實驗，均有陽性、陰性對照同時進行，陽性、陰性對照經過驗證。

1.4 結果判定 染色結果由有資質的病理醫生對染色后的組織片在光學顯微鏡下觀察并進行判讀。判讀標準：DAB顯色后，雜交陽性信號位于細胞核，呈棕褐色，雜交陰性的細胞的胞核經蘇木精復染成藍色。

2 結果

2.1 不同切片厚度EBER檢測結果 淋巴結活檢組織切片厚度分別為1 μm，2 μm，3 μm，4 μm，5 μm共5組，胃蛋白酶消化時間采用試劑盒推薦30 min，雜交孵育過夜。比較發現，1 μm組陽性信號不均，5 μm組細胞重疊明顯，蘇木精背景染色較深，影響觀察，其他三組染色效果接近。提示淋巴結活檢組織切片厚度選(3±1)μm均可，其中，切片3 μm時EBER檢測更穩定，效果更好，背景干凈，結果清晰易辨。

2.2 不同胃蛋白酶消化時間EBER檢測結果 選擇切片厚度3 μm，胃蛋白酶消化時間范圍5～30 min，進行5 min間隔的梯度時間消化，共6組，雜交孵育過夜。6組檢測結果顯示，胃蛋白酶消化5～15 min陽性信號較弱，低倍鏡下不易觀察，消化20～30min的組織雜交效果好，陽性細胞著色深，定位準確，無非特異性背景染色，因此，淋巴結活檢組織可縮短消化時間為20 min（圖1）。

2.3 不同雜交時間EBER檢測結果 在切片厚度3μm，胃蛋白酶消化20 min條件下，探針孵育時間設置2 h，4 h，過夜（16 h），共3組。結果顯示染色質量無明顯差異，雜交成功率高（圖2），提示淋巴結活檢組織EBER探針雜交時間可縮短至2～4 h。

圖1 不同消化時間EBER染色結果。A-F：蛋白酶消化時間分別為5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min。

圖2 不同探針雜交時間EBER染色結果。A-C：探針雜交時間分別為2 h，4 h，過夜（16 h）。

3 討論

惡性淋巴瘤種類繁多，發病機制復雜，近年來，淋巴瘤已成為發病率速度增長最快的淋巴造血系統惡性腫瘤[4]。大量研究發現EBV在伯基特淋巴瘤（BL）、NK/T細胞淋巴瘤、DLBCL及HL中檢出率顯著高于其他種類，推測EBV可能在腫瘤發病過程中起到重要作用。

EBER是EBV編碼的mRNA，在EBV感染的細胞核中高拷貝存在。原位雜交，可以對靶序列進行組織、細胞的空間定位。EBER原位雜交法因其準確的定位、極高的特異性和靈敏性已成為公認的EBV標準檢測方法，并作為病理輔助診斷的重要依據之一[5-6]。

由于原位雜交檢測步驟多，容易受各種因素（如組織標本的預處理、標本類型、胃蛋白酶的消化程度、雜交溫度及時間等）的影響。原位雜交操作流程的規范性至關重要，在日常檢測過程中，我們發現，干片、PBS清洗不足、DAB顯色時間過長等因素有可能引起組織內非特異性背景染色。蘇木素復染時間也不宜過長，否則會掩蓋拷貝數特別低的標本陽性顯色，影響判讀。

本研究中，選取的標本類型為淋巴結穿刺活檢組織，淺表淋巴結穿刺活檢及B超、CT引導下的深部淋巴結穿刺活檢創面小，安全系數高。盡管活檢組織多方向、多點取材等，仍有取材少或者涂片不清等易致漏診；且病理診斷往往被認為是診斷的金標準，對病理醫師的要求較高。在實際工作中，穿刺取樣還可能對組織形態結構造成不可逆影響，從而破壞細胞內蛋白及核酸的保存，并且，因穿刺組織較小，細胞豐富，處理不當易使組織收縮、變脆，制片需嚴格控制固定、脫水、透明、進蠟過程的時間及所用試劑的濃度。

為探索淋巴結穿刺活檢組織最適EBER原位雜交檢測條件，比較了不同切片厚度、不同蛋白酶消化時間、不同探針孵育時間下EBER原位雜交檢測的染色質量情況。切片過薄，不能保證切片中足夠的EBER核酸拷貝數，且手工檢測酶消化時間不容易把握陽性信號強度較弱；切片過厚，細胞重疊不利于觀察。酶消化的作用是增加組織的通透和增強探針的穿透，胃蛋白酶消化不足將影響探針與目標核酸雜交的結合程度，引起陽性減弱或假陰性等檢測結果；消化過度核酸周圍的蛋白結構會被破壞，在接下的實驗中核酸易丟失[7-8]。在以往的檢測中，為保證低拷貝樣本雜交效果，防止假陰性出現，常采用過夜雜交，在本研究中對2～4 h雜交效果也進行了比較。

目前最常用的原位雜交試劑分別有適用于手工和全自動免疫組化染色儀兩種類型的試劑盒，二者各有優缺點。傳統EBER檢測方法簡單易操作，但過程較長，總耗時近20 h，且易受環境及人為因素影響。全自動檢測實驗所需時間短，程序自動化控制，有利于質量標準化管理[9]，但已有研究[10]表明，在穿刺活檢組織中，手工染色檢測與全自動染色檢測相比，具有相對更好的特異性和敏感性，提示并非所有組織類型標本都適用于全自動檢測。

在本研究中，對淋巴結穿刺活檢組織的傳統EBER檢測條件進行優化，節省了整體檢測時間，實驗效果更佳，在病理診斷提速的同時更好地為臨床治療提供了可靠的依據。