胚胎絨毛細胞培養及核型分析在自然流產病因檢測中的應用

馮王富，張春玲，賴賓霞，謝文光，曾研章，何曉顏，陳文鋒

陽江市婦幼保健院檢驗科，廣東 陽江 529500

自然流產是目前婦產科臨床實踐中較為常見的一種病癥。臨床研究顯示，約有15%的女性會在孕早期發生原因不明的自然流產[1-3]。而從病理機制的相關研究來看，自然流產的發生不僅與多種外在環境因素的影響有關，也有較高比例的自然流產直接與胎兒的遺傳基因異?；蛉毕萦嘘P[4-5]。但隨著染色體核型分析技術的不斷進步，越來越多的醫院開始針對孕早期婦女開展絨毛細胞檢測，由于絨毛細胞是受精卵分化而來的中胚層細胞組成，其組織染色體與胎兒具有同源性，因此對于胎兒染色體的異常與否具有良好的檢驗和預測價值。本研究以改良式絨毛細胞培養法對早期自然流產的絨毛細胞進行培養，觀察早期流產胎兒的染色體異常狀況，以便對后續研究提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年5 月至2021 年5 月間于陽江市婦幼保健院進行常規妊娠檢查并確診為“胚胎停育”的73例早期流產孕婦作為研究對象，所有孕婦均符合以納入和排除標準。納入標準：①流產前B超檢查顯示胎兒已停止發育，未見心管搏動及胎芽；②孕周≤15 周，符合孕早期特征；③孕婦及其家屬同意進行流產絨毛染色體檢測。排除標準：①臨床檢查資料不全，不便開展臨床研究；②孕期存在嚴重感染或孕期存在有害有毒物接觸史。73例孕婦年齡21～43歲，平均(27.65±4.24)歲；孕周6～15 周，平均(9.85±1.24)周。本研究經我院醫學倫理委員會研究審核通過。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及培養 在孕婦同意進行流產絨毛組織染色體檢查后，于清宮手術中進行標本采集工作。具體流程：①在無菌操作流程下于孕婦宮內取出流產絨毛組織，將取出的絨毛組織置于2 只含有1萬U硫酸鏈霉素和青霉素的培養皿中進行清洗，以去除可能影響后續檢測結果的凝血塊及非絨毛組織；②挑選15～30 mg 優良絨毛置于15 mL 離心管口并用手術剪將絨毛組織剪成較為均勻的小枝，于離心管內加入5 mL 的0.25%胰蛋白酶培養液與人胎盤絨毛膜細胞完全培養基，置于37℃下進行3 min消化，消化中每1 min 搖勻一次離心管；③消化完成后加入5 mL 培養液，置于離心機內1 800 r/min 進行10 min 離心，保留下層沉淀混合物，混勻后分為2份分別加入5 mL培養瓶中，置于二氧化碳培養箱內進行培養；④培養7 d后取出組織塊進行觀察，當組織塊周圍出現梭形細胞增殖及雙圓形細胞時提示可以進行換液，換液后繼續培養1～2 d即可進行收獲，同時于換液時將2份舊培養基分別移入新離心管其中一份進行傳代培養使用另一份作為傳代培養的備用培養基于冰箱內0～4℃保存；⑤舊培養基于離心機內1 800 r/min 進行10 min 離心，保留下層沉淀混合物加入5 mL新培養基混勻后置入新培養瓶，培養瓶瓶蓋保持旋松狀態，并將培養瓶置于二氧化碳培養箱中進行傳代培養。

1.2.2 細胞收獲及閱片 加秋水仙素(20 μg/mL)

兩滴2.5小時后，用刮刀刮下貼壁細胞，然后用生理鹽水沖洗，放進15 mL離心管中。離心去上清，然后于培養瓶中加入已完成預溫的氯化鉀溶液，利用吸管充分吹打混勻后進行水浴箱溫育。溫育完成后加入1.5 mL已完成預溫的固定液(甲醇冰醋酸溶液)進行預固定，混勻后置于水浴箱中再次溫育并離心。保留下層沉淀混合物再次加入8 mL固定液，以水浴法溫育后再次離心固定，重復兩次固定。固定完成后再次加入固定液將下層沉淀混合物調勻為混懸液，滴取于冰片上后放入烤箱，75℃烤片3 h。選取常規G 顯帶，經胰酶消化漂洗后與姬姆薩溶液內進行染色2 min，然后沖洗吹干進行閱片。進行核型分析時每例樣本進行20 個分裂相計數，并分析5個核型，當核型分析出現嵌合體時計數加數50個核型，并計算嵌合比例。

2 結果

2.1 培養結果 在采用改良式原代培養聯合傳代培養所培養的73份樣本中，原代培養共培養成功胚胎絨毛細胞65例，培養過程中出現8例污染未貼壁生長，但借助傳代培養和備用培養基進行再次培養成功4 例，4 例培養失敗，共培養成功69 例，成功率為94.52%(69/73)。

2.2 胚胎絨毛染色體核型分析結果 69 例細胞樣本中檢出染色體異常核型45 例，占所有樣本的65.21%；正常核型24 例，占所有樣本的34.78%。其中，常染色體三體共14例，占異常核型的31.11%；性染色體單體共9例，占異常核型的20.00%；雙重三體共3例，占異常核型的6.67%；多倍體共10 例，占異常核型的22.22%；嵌合體共5例，占異常核型的11.11%；結構異常共4 例，占異常核型的8.89%。69 例自然流產患者的胚胎絨毛細胞染色體核型分布情況見表1，45 例胚胎絨毛細胞染色體異常核型的分布情況見表2。

表1 69例自然流產患者的胚胎絨毛細胞染色體核型分布情況

表2 45例胚胎絨毛細胞染色體異常核型的分布情況

3 討論

原發性自然流產是目前臨床上較為棘手的一類病癥，由于致使自然流產的潛在因素較多，臨床治療中主治醫師難以從常規的檢查資料中判斷患者的病因所在[6-7]。同時從現有研究來看，隨著孕產婦自然流產發生的次數增加，其再次發生自然流產的概率也隨之增加，這不僅會導致孕產婦出現習慣性流產，同時也會給患者及其家庭帶來極大痛苦[8-10]。因此，在未能確認自然流產的病因之前，應囑咐患者短時間內不再制訂妊娠計劃，以進行綜合檢查和治療干預來減少自然流產再次發生的可能[11]。

從相關的病因檢測研究來看，多數早期自然流產的成因依然是染色體異常，尤其是在孕期＜12 周的孕早期患者當中，染色體異常的比例高達50%～70%[12-14]。但由于傳統絨毛組織長期培養法的局限性，這些研究的絨毛細胞培養過程中難免會受到樣本污染、孕周誤差和患者停孕時間的影響，多數針對胚胎絨毛細胞培養的研究培養成功率只有60%～80%，從而使最終得出的數據和結論存在一定誤差和局限，且培養失敗的另一部分患者由于無法再提取絨毛組織故而無法繼續進行診斷[15-16]。而本研究采用目前較為新穎的改良式原代培養結合傳代培養及備用培養基的培養模式，避免了因操作失誤或是采集污染導致培養基無法貼壁生長的缺陷，雖有一部分培養基在原代培養中出現了未貼壁生長的情況，但在傳代培養的后續工作中均完成了胚胎絨毛細胞收獲，從而在研究方法上規避了傳統方法所對研究帶來的影響。而從研究結果來看也有力證實了這一點，在充分把握原代培養工作的準確性之上以傳代培養作為保險能有效確保胚胎絨毛培養檢查的成功率。而從研究的培養結果來看，73 例樣本中檢出45 例異常核型染色體，異常核型檢出率為65.21%，與謝金芳等[17]的研究結果基本一致。從45例異常核型的分布情況來看，非整倍體核型是占比最多的，尤其以性染色體單體和常染色體三體最多，從其發生機制上來看，非整倍體核型的出現主要與受精卵分化時染色體不分離或染色體缺失造成的，如典型的45，X 核型的發生主要因為父親一方染色體的缺失所導致[18]。除了非整倍體核型外，本研究還發現了一定比例的多倍體核型，且根據患者的臨床資料進行回顧分析，這些三倍體病例其術中所得的絨毛組織均呈現水泡狀，推測此部分患者存在部分性葡萄胎，存在雙雌受精的情況；研究中還發現了兩個較為罕見的四倍體病例，推測其與細胞核內染色體正常復制后的核膜粘連存在一定關系，遂而出現四倍體的情況。而從嵌合體的觀察結果來看，均可能與卵裂后出現的細胞系不分離有關，隨著細胞系不分離時間的拉長，嵌合體中部分染色體的比例便逐漸減小，更加難以檢出，遂而產生較多的46/47 型嵌合體。而從核型結構異常的幾個病例來看，其中3 例經外周血染色體溯源已證實為遺傳所致，剩余1 例則未在患者夫婦外周血染色體中檢出，推測為新發染色體結構異常，與環境因素所導致的突變有關。

綜上所述，胚胎染色體異常是依然是目前臨床自然流產的首要可能考量的病因之一，借助于更為先進的原代培養聯合傳代培養法可有效提升胚胎絨毛細胞的培養成功率，以便在后續核型分析中針對患者夫婦雙方提出具有針對性的檢查建議，以減少自然流產再次發生的可能。