慢性睡眠剝奪對大鼠髁突軟骨TGF-β1表達的影響

趙 琛，劉 陽，崔玉蘭*，白月輝，李明陽

(1.河北醫科大學口腔醫學院，河北省口腔醫學重點實驗室，河北省口腔疾病臨床醫學研究中心，河北醫科大學 口腔醫院修復科，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學口腔醫學院，河北 石家莊 050017)

顳下頜關節紊亂病(temporomandibular disorders,TMD)是以疼痛、下頜運動異常和彈響三大臨床特征為主的口頜面系統的常見病。其致病因素較多，目前臨床認為咬合和心理因素是其主要致病因素[1]。有研究認為睡眠障礙會對TMD的發生發展產生作用，很多患者在診斷為TMD之前都有過不良的睡眠經歷[2]。改良多平臺法(modified multiple platform method，MMPM)是一種常用的，操作方便的建立睡眠剝奪的方法，研究證明經過慢性睡眠剝奪的動物會變得煩躁、焦慮不安，進而引起心理上的應激狀態[3]。轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一種調節軟骨細胞分化、增殖的生長因子，參與了軟骨細胞生長發育和修復改建的過程[4]。然而，TGF-β在慢性睡眠剝奪引起的髁突病理性改變及改建中如何表達尚未有相關研究。本實驗擬通過MMPM法建立大鼠慢性睡眠剝奪模型，研究慢性睡眠剝奪大鼠髁突軟骨中TGF-β1的表達變化。

1 材 料 與 方 法

1.1實驗動物 Wistar 大鼠60只，雄性，8周齡，體重(220±10) g，購自河北省實驗動物中心(許可證號：SCXK冀2018-004)。大鼠先于河北醫科大學口腔醫院省重點實驗室適應性飼養1周，每天將大鼠放置于水箱中30 min以適應水環境，消除大鼠對于水環境的恐懼。將60只大鼠隨機分為實驗組、對照組和恢復組。實驗組大鼠接受1、2、3、4周睡眠剝奪后處死取材，恢復組在接受1、2、3、4周睡眠剝奪后籠養1周恢復睡眠，再處死。

本實驗所有操作均符合河北醫科大學動物實驗倫理委員會要求。

1.2實驗試劑與儀器 兔抗鼠TGF-β1一抗(美國Affinity Biosciences.OH公司)，通用二步法試劑盒(北京中山金橋)，MMPM實驗水箱、對照水箱(自制)，曠場實驗箱(自制)，組織包埋機(櫻花Tissue-Tek TEC5，美國)，超薄石蠟切片機(LEICA, 德國)，光學顯微鏡(OLYMPUS，日本)、多功能照相顯微鏡(OLYMPUSBX-63，日本)。

1.3慢性睡眠剝奪模型的建立 本實驗選擇MMPM建立慢性睡眠剝奪的大鼠模型。自制長寬高為110 cm×70 cm×40 cm的水箱，水箱內置15個6.3 cm直徑，8 cm高的小平臺，每個平臺間隔距離為15 cm。將水箱內注滿水，水面低于小平臺下1 cm，水溫保持在(20±2)℃，大鼠在小平臺上可自行進食，飲水。實驗室溫度控制在23～29 ℃，每天日光燈照射12 h后關燈黑暗12 h。小平臺組每日下午16∶00放入水箱內進行睡眠剝奪，次日上午10∶00取出放回鼠籠中。對照組與實驗組處理方法相同，區別于在小平臺上置金屬網，大鼠可在金屬網上自由活動及進行睡眠。對照組大鼠由于在小平臺上放置金屬網，允許快速動眼睡眠的發生，同時排除水環境等其他因素對實驗的干擾。

1.4慢性睡眠剝奪評價 所有大鼠在慢性睡眠剝奪結束后均進行曠場實驗。曠場箱是長寬高為100 cm×50 cm×50 cm的立方體實驗箱，箱壁不透明。箱底分為25個面積相等的正方形格子(邊長20 cm)。在曠場上方固定攝像設備記錄大鼠5 min內的活動情況。實驗時將攝像設備放置于曠場上方中央記錄大鼠水平活動得分、垂直活動得分。水平得分為跨越一格記1分(三爪及以上)，垂直得分為雙前肢同時離地抬起為1分。保證每一次實驗環境，如隔音、光強度、濕度、溫度等一致。實驗過程中禁止實驗人員被大鼠看到，抓取等操作輕柔切忌暴力，保持安靜，以免對大鼠行為產生干擾。曠場實驗開始前將大鼠放置于實驗箱中適應環境2 min，每只大鼠放入曠場中均面部朝向下方，背對實驗人員，且都放在曠場正中央位置。因大鼠活動度有時間性變化，故實驗統一選擇中午12∶00時進行，每只大鼠僅進行1次實驗。實驗后用75%酒精棉球擦拭箱底及側壁，清除大鼠排泄物，徹底干燥(約5 min)，以防止大鼠留下的氣味干擾后續實驗。

1.5大鼠TMJ標本制取 用過量10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，用75%酒精消毒大鼠頭部及頸部，采用斷頸方法處死大鼠。剝離大鼠頭部皮膚后剔除咬肌，顳肌等顳下頜關節周圍肌肉，完整取出雙側顳下頜關節(含關節窩、關節盤、下頜髁突及關節囊)。取出雙側顳下頜關節組織塊后置于4%多聚甲醛固定24 h。采用10%乙二胺四乙酸溶液脫鈣1個月(每1～2 d更換一次脫鈣液)，以探針穿刺骨組織無阻力感，可以穿透組織為脫鈣完成標準。

1.6HE染色 脫鈣完成后流水下沖洗過夜，梯度酒精脫水，浸蠟包埋(包埋時注意方向，髁突矢狀向平行于蠟塊底部，髁突外側朝外)。包埋完成后由關節外側向內側連續進行矢狀向切片，切片厚度為4 μm，37 ℃展片儀撈片，55 ℃烘片2 h備用。石蠟切片脫蠟至水：二甲苯Ⅰ液12 min，二甲苯Ⅱ液12 min，無水乙醇2 min，95%乙醇溶液2 min，85%乙醇溶液1 min，75%乙醇溶液1 min，流水沖洗。蘇木素溶液5 min，流水沖洗。鹽酸酒精分化1～2 s，流水沖洗。1%氨水反藍30 s，流水沖洗。伊紅溶液30 s，流水沖洗。75%乙醇溶液3 min，85%乙醇溶液3 min，95%乙醇溶液10 min，無水乙醇10 min。二甲苯5 min。封片。

1.7免疫組織化學染色 脫蠟與水化：二甲苯10 min×3次，無水乙醇10 min×3次，95%乙醇溶液3 min×2次，85%乙醇溶液3 min×2次，75%乙醇溶液3 min×2次，蒸餾水沖洗1 min，置于PBS緩沖液溶液中?？乖迯停簩⑽傅鞍酌溉芤旱蔚捷d玻片組織上，37 ℃恒溫箱內孵育30 min。PBS緩沖液沖洗3 min×3次。阻斷內源性過氧化物酶：將內源性過氧化物酶阻斷劑(SP-9001)滴加到載玻片組織上，室溫孵育20 min。PBS緩沖液沖洗3 min×3次。滴加一抗：滴加適量一抗(TGF-β1 1∶50)到載玻片的組織上，37 ℃孵育60 min。PBS緩沖液沖洗3 min×3次。滴加反應增強液：將適量反應增強液(SP-9001)滴加到載玻片組織上，室溫反應20 min。PBS緩沖液沖洗3 min×3次。滴加酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物：將酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物滴加到載玻片的組織上，室溫孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次。顯色：配制DAB顯色液，滴加到載玻片組織上，反應6 min，鏡下觀察染色。復染：自來水沖洗，蘇木素染色液染色30 min，流水沖洗，鹽酸酒精分化1～2 s，流水沖洗，氨水反藍30 s。脫水，透明，封片：75%乙醇溶液1 min，85%乙醇溶液1 min，95%乙醇溶液10 min，無水乙醇10 min，二甲苯5 min。中性樹膠封片。

1.8圖像采集與分析 利用OlympusBX-63顯微鏡觀察組織，使用顯微鏡配套相機系統及軟件拍攝圖像。HE染色圖像的照片選取整個髁突表面采集，免疫組織化學圖像選擇髁突中1/3與后1/3交界處的髁突軟骨(髁突軟骨對應關節盤中間帶處)，每張切片在該處隨機截取3個×400倍鏡下的視野(截取部位見圖1)，對所選取的每個區域中陽性細胞個數進行求和，取3個視野平均值作為陽性細胞表達強度。

圖1 圖像采集區域：髁突中1/3與后1/3交界處(SP ×400)

1.9統計學方法 應用SPSS 23.0統計軟件對數據進行分析。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1曠場實驗 曠場實驗結果顯示實驗組與恢復組結束睡眠剝奪時曠場實驗結果水平得分和垂直得分均高于對照組(P<0.05)，見表1，2，證明睡眠剝奪建模成功?；謴徒M在恢復睡眠1周后測試曠場實驗結果與對照組得分差異無統計學意義(P>0.05)，說明恢復組大鼠在恢復正常睡眠1周后已不再處于應激狀態。

表1 曠場實驗垂直得分Table 1 Vertical score of open field experiment 分)

表2 曠場實驗水平得分Table 2 Level score of open field experiment 分)

2.2軟骨髁突組織結構變化 對照組髁突軟骨表層光滑連續，表層纖維結構與髁突表面平行，排列緊密。髁突中部纖維軟骨帶約肥大細胞4～6層，細胞排列無明顯規律。

實驗組的髁突軟骨HE染色，可以觀察到髁突軟骨有增齡性變化，軟骨細胞層數隨時間增長而逐漸減少。1周實驗組與對照組髁突軟骨無明顯差別，2周實驗組細胞分層逐漸變得不清晰，增殖帶的小細胞有向下侵入圓形軟骨細胞層的現象發生。3周實驗組的這種現象更加常見， 4周實驗組還可以觀察到軟骨表層細胞間發生裂隙，軟骨深層與軟骨下骨界限不明顯。

恢復組與實驗組相比，表層纖維帶的裂隙減小，或是部分裂隙被纖維樣組織占據但內部尚無細胞長入。局部纖維軟骨帶細胞層數較周圍明顯增多，但細胞界限清晰，纖維軟骨帶中的圓形軟骨細胞增多，層數增加(圖2～4)。

2.3TGF-β1免疫組織化學染色結果 TGF-β1在增殖帶軟骨細胞和纖維軟骨帶的圓形軟骨細胞中有陽性表達，陽性細胞呈現包括胞漿與細胞外基質在內的棕黃色染色(圖5)。

對照組TGF-β1可見在髁突軟骨增殖層中表達，表達強度隨實驗時間的延長并未出現明顯變化，1、2、3、4周組之間表達差異無統計學意義(P>0.05)。

實驗組1、2、3、4周組間TGF-β1的表達隨實驗時間的延長而增多，與相應的對照組差異有統計學意義(P<0.05)。1周組表達部位位于增殖層細胞中，隨睡眠剝奪時間延長，深層肥大軟骨細胞逐步開始表達TGF-β1，且染色加深。

恢復組1、2、3、4周的TGF-β1表達較相對應實驗組減少(P<0.05)。睡眠剝奪1周恢復組TGF-β1表達較對照組差異無統計學意義(P>0.05)，睡眠剝奪2、3、4周時TGF-β1陽性細胞較對照組增多，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 TGF-β1在髁突軟骨的陽性細胞個數 Tab3 The number of positive cells of TGF-β1 in condylar cartilage

3 討 論

研究TMD病理機制的動物模型有很多，根據TMD疾病的致病因素，可分為通過改變咬合使關節負荷增大建立TMD模型，通過化學藥物注射建立TMD模型，通過外科手術切除關節盤建立模型或是通過基因工程等方式建立模型[5]。但隨著對TMD病因中心理因素的深入研究，尤其是睡眠障礙這一病因的探究，需要一種能廣泛應用于鼠類這種常用實驗動物的睡眠剝奪模型建立的方法。因此本研究的實驗組采用MMPM建立慢性睡眠剝奪模型的Wistar大鼠模型。MMPM法是一種干擾因素可控，建模效果明顯的睡眠剝奪方法，被廣泛應用于研究慢性睡眠剝奪引起動物應激狀態的實驗[2]。

曠場實驗常用于驗證慢性睡眠剝奪模型建立是否成功，曠場實驗可以驗證實驗動物自主運動行為、焦慮、抑郁程度。本實驗參考已有相關實驗的結果參數進行設定與分析，選擇記錄水平跨格數、直立次數綜合考慮評價，已有研究認為水平跨格數、直立次數的增加，表明實驗動物受睡眠剝奪導致的應激反應強烈[6]。本實驗結果顯示睡眠剝奪組在相同時間點的行為學記錄得分均高于對照組，證明慢性睡眠剝奪模型建立成功，對大鼠產生了較強的應激刺激。同時本實驗不同于以往研究，設計恢復組探討慢性睡眠剝奪成功后對實驗動物恢復正常睡眠，可否引起不同變化。該組大鼠在完成各時間點的睡眠剝奪后，立即進行曠場實驗，所得結果與對照組相比均有統計學意義，說明建模成功?；謴徒M大鼠在完成睡眠剝奪后恢復正常睡眠1周，再進行曠場實驗，此時恢復組大鼠得分與對照組得分相比差異無統計學意義，說明大鼠在恢復1周睡眠后，其應激狀態得到了一定的緩解。

正常的下頜髁突表面由一層纖維軟骨構成，根據軟骨內各部分結構的差異，可將髁突軟骨由表面向內分為4個帶：纖維帶、增殖帶、纖維軟骨帶和鈣化軟骨帶。纖維帶位于表面排列緊密整齊，纖維走形方向與軟骨表面平行，下層是具有小而密集細胞的增殖帶，再深層是包含圓形軟骨細胞的纖維軟骨帶，鈣化軟骨帶位于最深層與軟骨下骨相連。正常情況下各層細胞界限清楚，結構排列整齊。本實驗中發現經過慢性睡眠剝奪，實驗組大鼠髁突表層纖維出現裂隙、斷裂，細胞界限不清，軟骨下骨向軟骨層長入等退行性改變，與已有實驗結果相同[7-8]?；謴徒M與實驗組相比，髁突表層纖維帶裂隙減少，局部肥大細胞層數有增加，各層細胞界限較清晰，說明經過1周睡眠恢復，髁突軟骨退行性改變癥狀有了一定改善。

TGF-β是一類在骨形成和骨改建過程中起重要調控作用的細胞因子，包含 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等多個成員，近年來大量實驗證明，TGF-β可在一定程度上促進骨的修復再生[9-11]。TGF-β可以促進軟骨細胞的增殖和分化，并控制細胞外基質的合成和降解。有研究認為TGF-β在生長發育期表達增加，隨著生長發育停止而逐漸減少[12]。本實驗中對照組中TGF-β1表達呈現下降趨勢，可能與增齡性變化有關。有研究將關節軟骨碎塊化后發現TGF-β1存在過表達的現象，且過表達的TGF-β1能夠促進軟骨細胞遷移,促進軟骨損傷的修復[13]。有學者利用天然高分子乙烯基之間的化學作用，制備了TGF-β負載光聚合殼聚糖/絲蛋白生物水凝膠基質，觀察發現可以有效的促進軟骨細胞增殖，認為TGF-β可以用于軟骨組織再生[14]。Wiegertjes等[15]通過收集衰老的OA樣關節軟骨細胞，發現TGF-β可以抑制白細胞介素6的表達，減緩關節軟骨變性。因此，可以認為TGF-β對骨關節炎的發展與修復密切相關。王軻等[6]認為慢性睡眠剝奪引起大鼠應激態后，大鼠髁突微環境發生變化，導致局部炎癥因子表達增加。有研究發現，在關節炎癥初期，軟骨受到輕微損傷引起TGF-β1表達增加，TGF-β1會增加膠原纖維、蛋白多糖的合成，修復炎癥因子對微環境所造成的破壞[16]。而當關節炎癥發展到一定程度時，軟骨基質進一步降解，軟骨細胞肥大、凋亡，TGF-β在軟骨內的合成作用小于分解作用，軟骨組織合成代謝的速度低于分解代謝，最終炎癥向終末發展[17]。本實驗中，軟骨組織因慢性睡眠剝奪而發生退行性改變，軟骨細胞分泌TGF-β1增加。睡眠剝奪初期未能觀察到明顯組織變化，直到剝奪睡眠2～3周時才發現組織內的退行性，與已有研究一致。在恢復組中，睡眠剝奪1周恢復組TGF-β1表達與對照組差異無統計學意義，提示短時間的睡眠剝奪對髁突的影響可能會隨著睡眠恢復而很快恢復。睡眠剝奪2、3、4周恢復組較實驗組TGF-β1表達下降可能是因為隨著軟骨適應性改建需求的下降，TGF-β1分泌減緩所致，但較對照組仍有顯著性增高則表示髁突軟骨依舊處于改建恢復過程中?；謴徒M在HE染色中局部的肥大軟骨細胞增多，可能是由于TGF-β1對軟骨細胞的分化增殖有促進作用有關。有研究表明TGF-β1過度表達會引起軟骨組織的增生，尤其是肥大細胞的數量增加[18]。

通過本研究可以發現，MMPM可以引起顳下頜關節髁突軟骨的退行性表現，而在此過程中TGF-β1作為一種包含軟骨組織的生長因子產生了重要作用。但本實驗未能從細胞和分子水平探討其具體作用機制，還需進一步研究。(本文圖見封三)