鐵死亡研究進展與惡性腫瘤治療

虞晶晶(綜述)，穆 丹，朱慶豐(審校)

(安慶師范大學生命科學學院綜合教研室，安徽 安慶 246133)

鐵死亡是近年來發現的一種新的死亡方式，鐵死亡的發生往往是由于細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累，還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)的耗竭，最終導致鐵依賴的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)氧化，脂質過氧化會破壞質膜結構，致使細胞死亡[1]。癌癥是除了心血管疾病外致死率最高的疾病，癌癥的發生必定伴隨著原癌基因的活化和抑癌基因的失活[2]。調控鐵死亡的基因經常發生突變，使得腫瘤對鐵死亡更敏感。腫瘤細胞中原癌基因的活化會導致ROS的積累，腫瘤細胞為了抵抗過高的ROS，會提高細胞的抗氧化能力[3]。如果干預腫瘤細胞內的氧化還原平衡，很可能會發生鐵死亡，達到治療腫瘤的目的[4]。

1 鐵死亡發現

鐵死亡的第一次發現是在2003年，當時篩選能夠殺傷大鼠肉瘤(rat sarcoma，Ras)突變腫瘤細胞的小分子藥物時，找到了一種新型的藥物erastin，erastin能夠使細胞很快死亡，并且這是一種與凋亡、程序性壞死等完全不同的死亡方式。但是當時并沒有找到erastin的靶點。隨后在2008年，又發現了其他藥物RSL3和RSL5也能導致同樣的腫瘤細胞死亡。最終在2012年，將這種死亡方式命名為鐵死亡，這是一種鐵依賴性的，與凋亡、程序性壞死等完全不同的死亡方式，往往伴隨著脂質ROS的積累，并且發現erastin的靶點是胱氨酸/谷氨酸反向轉運體，erastin能抑制胱氨酸攝取，降低細胞內還原性谷胱甘肽的合成[5]。

在2014年，Yang等[6]發現了另一個重要的調節蛋白谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)，GPX4是細胞內產生還原性谷胱甘肽抵抗鐵死亡的關鍵分子。在2017年Doll等[7]鑒定了乙酰輔酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)在鐵死亡中的重要作用，ACSL4是合成多不飽和脂肪酸的關鍵酶，決定了細胞對鐵死亡的敏感度。隨后在2019年，又發現了鐵死亡抑制蛋白在抵抗鐵死亡中的作用[8]。近2年又有了很多新的突破性的發現，2020年，Riegman等[9]發現鐵死亡可以在細胞之間傳播(圖1)。最新的研究又發現在小鼠體內，淋巴中的油酸會保護轉移的黑色素瘤細胞免于鐵死亡[10]。鐵死亡的研究進展十分迅速，近年來隨著CRISPR-Cas9技術的發展和成熟，基于全基因組的CRISPR-Cas9篩選對于發現鐵死亡中的重要基因提供了極大幫助，其他一些關鍵節點分子也逐漸被鑒定出來[11]。

圖1 鐵死亡發現歷程

2 鐵死亡特征

2.1形態學特征 細胞鐵死亡表現為細胞膜破裂、輕微的染色質凝集和細胞腫脹。與細胞凋亡、程序性壞死、細胞自噬不同的是，鐵死亡細胞在電子顯微鏡下能觀察到線粒體異常，如線粒體凝集或腫脹、膜密度增加、嵴減少或缺失以及線粒體外膜破裂，這些特征已經是作為檢測鐵死亡發生的重要標志[5,11]。

2.2生化特征 鐵死亡是一種ROS導致的細胞死亡方式，有2個重要的標志：鐵積累和脂質過氧化。細胞中積累的Fe2+通過芬頓反應產生額外的羥基自由基，造成氧化損傷。另外，鐵可以提高脂氧合酶和脯氨酸羥化酶的活性[1]，產生鐵死亡的另一個生化特征：脂質過氧化(表1)。

細胞中的脂肪酸包括飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)、PUFA，其中PUFA是細胞膜磷脂的重要組成成分，PUFA在ROS的攻擊和脂氧合酶的作用下產生脂質過氧化物，發生斷裂和縮短，并釋放一些小的脂肪族產物4-羥基烯醛等，最終導致細胞膜破裂、細胞死亡。這也是檢測鐵死亡發生的重要依據[12]。

表1 鐵死亡與凋亡、程序性壞死和自噬比較

GPX4：谷胱甘肽過氧化物酶4；TFR1：轉鐵蛋白受體1；SLC7A11：溶質載體家族7成員11；NRF2：核因子E2相關因子2；HSPB1：熱休克蛋白β-1；ACSL4：?；o酶A合成酶長鏈家族成員4；FSP1：鐵死亡抑制蛋白1；Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶；Bcl-2：B淋巴細胞瘤2；Bax：Bcl-2相關的x凋亡調節因子；RIP1：受體相互作用蛋白1；RIP3：受體相互作用蛋白3；ATG5：自噬相關蛋白5；ATG7：自噬相關蛋白7；LC3：微管相關蛋白1輕鏈3；TFEB：轉錄因子EB

3 鐵死亡調控機制

3.1SystemXc-轉運胱氨酸 SystemXc-是一個廣泛分布在磷脂雙分子層膜上的氨基酸轉運蛋白，主要包含2個亞基SLC7A11和SLC3A2。SystemXc-負責將胱氨酸轉運進入細胞，同時將等量的谷氨酸轉運出細胞。胱氨酸進入細胞后被還原形成2個半胱氨酸，半胱氨酸是合成還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)的原料，GSH通過谷胱甘肽過氧化物酶降低細胞內的ROS和脂質過氧化。抑制SystemXc-的活性會降低胱氨酸吸收和還原性谷胱甘肽合成，最終導致氧化損傷和鐵死亡。經典的erastin和索拉非尼能通過抑制SystemXc-來誘導鐵死亡[13]。最近的文獻表明P53蛋白也可以抑制SystemXc-的活性，從而降低細胞的抗氧化能力，導致細胞對鐵死亡敏感[14]。

3.2GPX4抑制鐵死亡 在所有的谷胱甘肽過氧化物酶家族中，GPX4在鐵死亡的調控過程中占據著最重要的位置，同時也是調控鐵死亡最關鍵的一環。GPX4利用GSH將過氧化的脂質還原為相應的醇類。抑制GPX4會誘導鐵死亡發生，如RSL3及相關的衍生藥物。敲低GPX4或者在GPX4表達水平較低的細胞中，對鐵死亡也更加敏感[6]。另外，GPX4是人體中25個硒蛋白之一，GPX4發揮催化作用需要硒的參與，硒的水平也會影響GPX4的表達水平[15]。

3.3鐵在鐵死亡中的作用 從鐵死亡的名稱中可看出，鐵死亡的發生依賴鐵元素。首先，鐵元素可以推動芬頓反應的進行，催化過氧化氫產生羥自由基。然后在GPX4受到抑制的情況下，羥自由基攻擊多不飽和脂肪酸產生過氧化的脂質，過氧化的脂質又可以在鐵的催化作用下產生新的自由基，導致鏈式反應進行，促進脂質過氧化的進一步傳播[16]。

在體內，小腸吸收和紅細胞裂解產生的Fe2+首先被銅藍蛋白氧化為Fe3+，Fe3+可以結合細胞膜上的轉鐵蛋白，形成的復合物又被細胞膜上的轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor-1，TFR1)識別并幫助其內吞進入細胞內。細胞內的Fe3+在金屬還原酶家族3的作用下被還原成為Fe2+，Fe2+一方面以游離的鐵離子形式構成細胞內的鐵池，另一方面也可以儲存在鐵蛋白中，發揮廣泛的作用。因此，如果干擾TFR1的表達，可以顯著降低細胞內的鐵離子濃度，抑制鐵死亡。然而，血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)催化血紅素降解產生游離的鐵，HO-1的過表達能夠加速erastin誘導的鐵死亡。

3.4ROS 細胞內的ROS包括超氧陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)。線粒體在進行氧化磷酸化產生ATP時，因電子傳遞過程發生電子滲漏或者通過細胞膜上的NADPH氧化酶產生超氧陰離子，超氧陰離子在超氧化物歧化酶的作用下形成H2O2，H2O2被鐵等金屬元素催化產生羥自由基，誘導脂質過氧化導致鐵死亡(圖2)[17]。

在腫瘤細胞中，由于原癌基因的活化，細胞會產生ROS。而且腫瘤細胞快速增殖需要大量的營養物質和能量，細胞會發生代謝重編程，線粒體功能異常，也會產生較多的ROS。有研究表明一定程度的ROS能夠傳導增殖信號，促進腫瘤發生發展[18]。但是過高的ROS也會導致細胞死亡，因此腫瘤細胞需要提高其抗氧化水平來維持氧化還原平衡。有效地促進腫瘤細胞發生鐵死亡主要包括2種方法：一種方法是增加ROS產生，如一些傳統的化療藥物5-氟尿嘧啶、奧利沙鉑和紫杉醇等。另一種是降低腫瘤細胞內抗氧化能力，如抑制腫瘤細胞內抗氧化的核因子E2相關轉錄因子(nuclear factor E2-related factor 2，NRF2)[4]。

圖2 鐵死亡調控機制

4 鐵死亡與惡性腫瘤治療

腫瘤抑制因子如p53可以調控腫瘤細胞鐵死亡的發生。此外，已經有許多FDA批準的用于腫瘤治療的小分子臨床藥物被發現能活化鐵死亡，并且在多種腫瘤模型中誘導鐵死亡能夠有效抑制腫瘤增殖。最重要的是發現鐵死亡可以有效殺傷一些化療抵抗的腫瘤[19]。

4.1p53介導的鐵死亡調控 p53是重要的抑癌基因，腫瘤細胞中突變頻率最高的基因，大約有50%以上的惡性腫瘤會發生p53的突變。p53的功能主要包括細胞周期阻滯，促進凋亡、衰老，調控細胞代謝，抑制細胞異常增殖[20]。野生型的p53主要被認為能促進鐵死亡從而抑制腫瘤增殖，p53可以下調SystemXc-轉運蛋白的表達水平來促進鐵死亡。但是腫瘤中p53往往發生突變，當p53的K117，K161和K162發生突變時，p53會喪失對鐵死亡的促進[14]。

4.2鐵死亡誘導劑的抗腫瘤治療潛力 依據誘導鐵死亡發生的不同方式將藥物分成4種類型。第1類：降低GSH水平；第2類：直接抑制GPX4；第3類：降解GPX4和CoQ10；第4類：提高鐵水平誘導脂質過氧化(表2)。

4.2.1第1類鐵死亡誘導劑 抑制腫瘤細胞的抗氧化系統會使它們更容易受到氧化損傷和細胞死亡，抗氧化的GSH被認為是腫瘤細胞的“阿喀琉斯之踵”。細胞內GSH合成原料的胱氨酸來源主要有systemXc-和轉硫作用。而在部分腫瘤中，轉硫作用通路會因為突變或表觀修飾而失活，此時腫瘤細胞高度依賴于systemXc-來攝取胱氨酸，systemXc-的抑制劑可以發揮促進鐵死亡抑制腫瘤的作用[21]。在第一類鐵死亡誘導劑中，erastin在宮頸癌和卵巢癌中都有很好地抑制腫瘤的作用。另外2種erastin的衍生物piperazineerastin和imidazoleketoneerastin在纖維肉瘤和淋巴瘤模型中也有很好的作用[6,22]。FDA批準的systemXc-的另一種抑制劑sulfasalazine本身是用于治療關節炎，現在發現也可以抑制淋巴瘤、胰腺癌和肺癌的增殖。另外一種老藥索拉非尼也被提出可以抑制systemXc-誘導鐵死亡。

4.2.2第2類與第3類鐵死亡誘導劑 在部分腫瘤中抑制systemXc-并不能發揮作用，可能因為這些腫瘤并不依賴systemXc-來合成GSH，或是在抑制systemXc-后腫瘤細胞有補償通路來提供抗氧化能力。此時直接靶向GPX4的第2類和第3類抑制劑成為更好的抑制腫瘤的策略[19]。RSL3是用的最多的GPX4抑制劑，在纖維肉瘤和眾多細胞模型中能顯著誘導鐵死亡發生[6]。WithaferinA可以抑制神經母細胞瘤增殖，altretamine可以抑制彌散性大B細胞淋巴瘤和骨肉瘤增殖[23]。

4.2.3第4類鐵死亡誘導劑 相比于正常細胞，腫瘤細胞對鐵有更高的需求，被稱為腫瘤細胞的“鐵成癮”，這使腫瘤細胞更容易在提高鐵水平時發生鐵死亡。比如，腎癌中富含鐵的腫瘤微環境促進腫瘤細胞發生鐵死亡[21]。withaferinA除了可以抑制GPX4外，也能通過降解血紅素提高鐵的含量誘導鐵死亡，同樣FINO2能夠抑制GPX4和氧化三價鐵來誘導腫瘤細胞發生鐵死亡[23-24]。此外，一些搭載鐵的納米材料也能夠誘導腫瘤發生鐵死亡[25]。

表2 鐵死亡誘導劑

5 總結與展望

鐵死亡是一種獨特的細胞死亡方式，它將細胞代謝中不同元素聚集在一起，包括鐵、硒、氨基酸、脂類和氧化還原穩態。隨著鐵死亡研究的進展，開始認識到其在廣泛的生物過程中起著重要作用，包括正常生理和多種病理情況下。許多證據表明，鐵死亡能夠抑制腫瘤增殖[1]。利用鐵死亡抑制增殖在針對化療抵抗的腫瘤中發揮了很好的效果。很多FDA批準的小分子藥物包括阿替拉胺、索拉非尼和納米藥物在誘導鐵死亡抑制腫瘤方面表現出了良好的前景[26]。雖然對鐵死亡的研究越來越深入，但仍然存在幾點尚未清楚的地方值得繼續探究。第一，如何定義細胞發生鐵死亡。目前常用的方法是通過電鏡直接觀察細胞的線粒體形態，以及利用質譜和熒光探針檢測細胞是否發生脂質過氧化。另一種方法是加鐵死亡抑制劑觀察細胞死亡是否減少，如果死亡減少則認為發生的細胞死亡是鐵死亡。但是這2種方法都有明顯的不足，電鏡觀察和檢測脂質過氧化都十分繁瑣并且難以普及，鐵死亡抑制劑則不夠直接，不完全令人信服，而且這2種方法無法在體內檢測鐵死亡。如果能夠找到直接的鐵死亡標志物，并且易于檢測，那么對于鐵死亡的研究進一步發展將是極大的提高。目前還在推進使用的方法是用探針檢測鐵的含量或者用抗體檢測一些能調控鐵死亡發生的重要節點蛋白，包括轉鐵蛋白受體1和谷胱甘肽過氧化物酶4，以及脂質過氧化釋放的小的脂肪族產物4-羥基烯醛等。第二，對鐵死亡深入機制的探究。找不到通用的廣為接受的鐵死亡標志物，很大一部分是因為對鐵死亡機制的不完全了解。比如在進行到哪一步后鐵死亡將不可停止和逆轉，以及細胞最終死亡的機制等。鐵死亡機制的深入探究，將會對鐵死亡在臨床上的應用發揮重要的作用。第三，在臨床前和臨床治療腫瘤環境中，鐵死亡誘導的特異性是什么？如何控制潛在的不良影響？腫瘤的基因突變能多大程度上影響鐵死亡的敏感性？腫瘤細胞的表觀修飾對調控鐵死亡有何作用？腫瘤免疫治療與鐵死亡是否能相互協同？納米材料在鐵死亡治療腫瘤中具體能發揮多大的作用等。

總之，鐵死亡領域仍有很多值得探索的方向，在臨床上的應用也越來越重要。隨著更多現象的發現和機制的深入探究，這種與凋亡、細胞程序性壞死和細胞自噬完全不同的死亡方式必將能與之共同出現在教科書上。