琥珀消石顆粒對腎臟草酸鈣結石大鼠BMP2通路及炎癥應激反應的影響

劉玉剛，張石軍，劉龍，史馬龍

榆林市第一醫院泌尿外科，陜西 榆林 719000

腎結石是常見的泌尿系統疾病，外科治療雖然能夠有效清除結石，但卻無法消除結石形成的病因，因此復發率較高[1]。草酸鈣結石是最常見的腎結石類型，骨形成蛋白2(bone morphoenetic protein 2，BMP2)通路激活造成鈣鹽過度沉積、炎癥反應及氧化應激反應激活造成腎草酸鈣小管上皮細胞損傷與結石形成密切相關[2-4]。近年來，中醫中藥在腎結石治療中的價值受到越來越多關注。琥珀消石顆粒由赤小豆、當歸、琥珀、海金沙、金錢草、雞內金、蒲黃、牛膝組成，是治療泌尿系結石、膽結石的常用中成藥。國內馬治中的動物實驗證實，琥珀消石顆粒對腎結石大鼠的腎臟病理改變及鈣結晶沉積具有改善作用[5]，但與之相關的分子機制并不清楚。本研究將以BMP2通路及炎癥應激反應為切入點，分析琥珀消石顆粒用于腎臟草酸鈣結石大鼠治療的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠10只、成年遺傳性高鈣尿結石雄性大鼠(SD遺傳背景)20只均購自上海南方模式生物公司，生產許可SCXK(滬)2019-0002。

1.2 藥物 琥珀消石顆粒(山東沃華醫藥公司，國藥準字Z37020101)，15 g/袋、10袋/盒。

1.3 試劑與儀器 Von Kossa鈣染色試劑盒(西安赫特生物公司，ST087)，骨形態發生蛋白2(BMP2)、Runt相關轉錄因子2(RUNX2)一抗(美國Abcam公司)，白介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒(上海西唐公司)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(南京建成研究所)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及給藥 成年雄性SD大鼠10只作為對照組，成年遺傳性高鈣尿結石雄性大鼠隨機分為模型組和治療組各10只，模型組給予10 mL/kg純水灌胃，2 次/d；治療組給予琥珀消石顆粒3.335 g·kg-1·d-1、每日分2 次灌胃，每次灌胃用10 mL/kg 純水溶解。連續治療4周。

1.4.2 尿液中草酸及鈣含量的檢測 末次灌胃后將大鼠放入代謝籠內，收集24 h 尿液，采用全自動尿液生化分析儀檢測草酸含量及鈣含量。

1.4.3 腎臟內鈣沉積的檢測 完成24 h 尿液樣本收集后，腹腔注射1.0%戊巴比妥鈉麻醉后解剖左側腎臟，用4%多聚甲醛固定后制作病理切片，按照試劑盒說明書進行Von Kossa 鈣染色，在顯微鏡下觀察染色呈黑色的鈣鹽沉積情況。

1.4.4 腎臟中BMP2表達的檢測 收集右側腎臟組織，加入組織裂解液提取組織蛋白，將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠內進行Western blot 檢測，電泳、電轉膜、5%脫脂牛奶封閉后孵育BMP2、RUNX2、β-actin一抗過夜，次日孵育二抗，最后在凝膠成像系統中顯影得到蛋白條帶、計算條帶吸光值，以β-actin 條帶的吸光值為內參，計算BMP2、RUNX2的表達水平。

1.4.5 腎臟中炎癥指標及氧化應激指標的檢測 另取右側腎臟組織適量，加入組織裂解液提取組織蛋白，按照試劑盒進行實驗，檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、SOD的含量。

1.5 統計學方法 采用SPSS21.0 軟件錄入數據并進行統計學處理，實驗數據均為計量資料，以均數±標準差()表示，三組間比較采用方差分析，有統計學差異的資料進一步采用LSD-t 檢驗進行兩兩比較。檢驗水準為α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠腎臟內鈣鹽沉積比較 對照組大鼠腎間質內未見鈣鹽沉積，模型組大鼠腎間質內可見明顯鈣鹽沉積，治療組大鼠腎間質內鈣鹽沉積與模型組比較明顯減少，見圖1。

圖1 三組大鼠腎臟內鈣鹽沉積的Von Kossa鈣染色(×200)

2.2 三組大鼠24 h 尿草酸及鈣含量比較 與對照組比較，模型組大鼠24 h尿草酸及鈣含量均明顯升高，與模型組比較，治療組大鼠24 h 尿草酸及鈣含量均明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 三組大鼠24 h尿草酸及鈣含量比較()

表1 三組大鼠24 h尿草酸及鈣含量比較()

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別24 h尿鈣含量(μmol)只數24 h尿草酸含量(mg)對照組模型組治療組F值P值13.75±2.75 62.44±10.34a 29.37±5.12b 19.292 0.001 10 10 10 63.83±11.37 161.38±27.65a 94.17±15.57b 13.474 0.001

2.3 三組大鼠腎臟中BMP2、RUNX2 表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠腎臟中BMP2、RUNX2的表達水平均明顯升高，與模型組比較，治療組大鼠腎臟中BMP2、RUNX2 的表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2和圖2。

圖2 三組大鼠腎臟中BMP2、RUNX2表達水平

表2 三組大鼠腎臟中的BMP2、RUNX2表達水平比較()

表2 三組大鼠腎臟中的BMP2、RUNX2表達水平比較()

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別BMP2只數RUNX2對照組模型組治療組F值P值0.68±0.09 0.98±0.10a 0.74±0.08b 5.686 0.006 10 10 10 0.65±0.08 1.09±0.15a 0.77±0.10b 6.123 0.002

2.4 三組大鼠腎臟中炎癥反應指標比較 與對照組比較，模型組大鼠腎臟中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均明顯升高，與模型組比較，治療組大鼠腎臟中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 三組大鼠腎臟中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較()

表3 三組大鼠腎臟中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較()

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別對照組模型組治療組F值P值IL-6(pg/mL)152.67±29.24 371.45±65.37a 226.51±54.29b 12.383 0.001只數10 10 10 IL-1β(ng/mL)0.93±0.15 2.85±0.47a 1.42±0.26b 15.812 0.001 TNF-α(ng/mL)1.66±0.28 4.31±0.84a 2.93±0.55b 14.202 0.001

2.5 三組大鼠腎組織氧化應激指標比較 與對照組比較，模型組大鼠腎臟中MDA 的含量均明顯升高、SOD的含量明顯降低，與模型組比較，治療組大鼠腎臟中MDA的含量明顯降低、SOD的含量明顯升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 三組大鼠腎臟MDA、SOD含量比較()

表4 三組大鼠腎臟MDA、SOD含量比較()

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

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3 討論

草酸鈣結石是最常見的腎結石類型，臨床治療腎結石的主要方式是外科碎石和排石，效果確切，但因為無法消除結石形成的原因，所以排石治療后的復發率高。腎結石的發病原因復雜，尿鈣排泄增加、鈣鹽在腎臟內過度沉積是造成腎結石的直接原因，針對性減少尿鈣排泄是治療腎結石的潛在途徑[6-7]。本研究以遺傳性高鈣尿結石大鼠作為腎結石模型大鼠，通過Von Kossa鈣染色及24 h尿液檢測證實：模型大鼠腎間質內鈣鹽明顯沉積，24 h 尿鈣含量及草酸含量均明顯增加，表明鈣鹽沉積、尿鈣排泄增多與腎結石的發病有關，與既往關于腎結石發病相關因素的研究一致。

中醫中藥是目前臨床上治療結石的常用方式，其中琥珀消石顆粒在腎結石、膽結石等疾病的治療中展現出積極價值[8-9]。該顆粒方劑中的多種中藥成分具有利小便、通淋、通經絡、化瘀血的功效。腎結石屬于中醫“石淋”、“尿血”的范疇，發病與腎氣虧虛以及下焦濕熱有關，使用琥珀消石顆粒能夠針對腎結石的中醫病機發揮治療作用[10-11]。本研究采用琥珀消石顆粒灌胃的方式對腎結石模型大鼠進行干預，干預后發現腎間質內鈣鹽明顯減少，24 h 尿鈣含量及草酸含量均明顯降低，表明琥珀消石顆粒治療腎結石大鼠能夠減少鈣鹽沉積及尿鈣排泄。

隨著近些年分子生物學研究的進展，多項研究從分子層面闡明了腎結石發病的可能機制。BMP2是成骨分化過程中參與礦化調控的關鍵基因，該基因能夠刺激鈣沉積。白栩搏的動物實驗證實，在特發性高鈣尿大鼠腎結石形成過程中，腎臟內BMP2 及下游RUNX2的表達水平明顯增加，提示BMP2通路參與腎結石的形成[2]。本研究對腎結石模型大鼠腎臟內BMP2 通路的分析結果與白栩搏的研究結果一致，即模型組大鼠腎臟內BMP2 及RUNX2 的表達水平高于對照組；加用琥珀消石顆粒治療后，腎臟內BMP2 及RUNX2 的表達水平明顯降低，表明琥珀消石顆粒治療腎結石的作用與抑制BMP2通路有關。

在腎結石的發病過程中，鈣鹽沉積是始動因素和刺激因素，過度沉積的鈣鹽能夠刺激炎癥反應和氧化應激反應，大量生成的炎癥因子及自由基會造成腎小管上皮細胞損傷，進而加重鈣鹽沉積、促進腎結石發病[12-14]。IL-1β、IL-6、TNF-α是重要的炎癥因子[15]，MDA 是自由基與脂質發生氧化應激反應的產物，SOD 是促進自由基代謝的抗氧化酶[16]。本研究的分析結果顯示：腎結石模型大鼠腎臟內IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA 的含量增加，SOD 的含量降低，與既往關于腎結石發病過程中炎癥及氧化應激反應激活的認知一致；加用琥珀消石顆粒治療后，腎臟內IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA的含量降低，SOD 含量增加，表明琥珀消石顆粒治療腎結石的作用與抑制炎癥反應和氧化應激反應有關。

綜上所述，琥珀消石顆粒明顯改善腎臟草酸鈣結石大鼠的腎間質鈣鹽沉積，這一作用與抑制BMP2通路及炎癥應激反應激活有關，未來琥珀消石顆粒有望成為防治腎結石的新藥物，BMP2通路及炎癥應激反應則有望成為研究腎結石發病機制及防治手段的新靶點。