TMEM65表達對乳腺癌患者預后的影響

李 健王 顏

1.泰安市中心醫院乳腺疾病診療部，山東泰安 271000； 2.山東農業大學信息科學與工程學院應用數學系，山東泰安 271000

根據2018年美國癌癥協會報道，乳腺癌是目前最常見的異質性惡性腫瘤，發病率和死亡率均較高［1］。據估計2020年美國浸潤性乳腺癌的發病率接近260 000，每年死亡人數超過40 000人［2］。在中國乳腺癌發病率同樣不斷上升［3］。目前乳腺癌有多種治療方法，如手術、化療、放療、內分泌治療、靶向及免疫治療等，乳腺癌患者的總生存期在過去的二十年中有所提高，但三陰性乳腺癌患者的預后仍然較差，無病生存期和總生存期較短［4］。而且由于耐藥性的產生，乳腺癌患者的生存期已經達到一個平臺期［5］。雖然發現了許多新的預后指標，如FMR1、MRP、GALNT6、SIS等［6-8］，但仍然無法明顯提高診斷和預測能力，因此，有必要探索新的分子病理診斷和預后預測指標，以指導個體化治療，甚至超越現有的乳腺癌分子分型［9］。

跨膜蛋白65（TMEM65）是一種定位于線粒體內膜的完整膜蛋白，其表達受類固醇受體RNA激活劑（SRA）調控［10］，TMEM65 基因突變可導致具有嚴重神經系統表現的線粒體肌?。?1］。近年來，TMEM65在癌癥中的重要性逐漸引起研究者的注意，研究發現TMEM65 在前列腺癌、肝癌和肺癌中顯著高表達，并且是肺癌的獨立預后標志物［12-14］，但其在乳腺癌中的研究較少。本研究旨在通過對癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中乳腺癌的表達和臨床信息數據進行生物信息學分析，評估TMEM65 基因在乳腺癌中的表達和對預后的意義，進一步為指導臨床治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 數據收集和整理

本 研 究 從TCGA 數 據 庫（https：//portal. gdc.cancer. gov/）下載了33種癌癥包括乳腺癌患者數據集的mRNA 測序數據（其中乳腺癌1 222 個樣本，FPKM（fregments per kilobase per million）格式的RNAseq數據已進行log2轉化）和臨床樣本信息。排除下列樣本：（1）一半以上“0”基因表達值；（2）存活信息不足。本研究共納入1 083例具有相應臨床特征的乳腺癌患者。由于TCGA數據庫在特定指南下向公眾開放，因此確認在數據收集之前已獲得所有書面知情同意。TCGA屬于公共數據庫，數據庫中涉及的患者已獲得倫理批準。用戶可以免費下載相關數據進行研究并發表相關文章。本研究基于開源數據，因此不存在倫理道德問題和其他利益沖突。

1.2 根據TMEM65中位表達進行分組的臨床特征對比

對比TMEM65表達高低分組之間的臨床特征，再對各個臨床變量進行分組，對比不同亞組之間TMEM65的表達差異。

1.3 根據TMEM65基因表達分組的差異表達基因

根據TMEM65 基因表達中位值，將1 083 例乳腺癌患者分為高TMEM65 表達組和低TMEM65 表達組。使用R 軟件包“DESeq2”計算兩組之間的差異表達基因（DEGs），將對數倍變化大于1.5，調整后的P值小于0.05 設置為閾值。R 軟件包“Pheatmap”和“EnhancedVolcano”應用于以熱圖和火山圖的形式呈現。

1.4 乳腺癌中根據TMEM65表達分組的基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

根據上述分組，使用GSEA 4.10 軟件進行GSEA 分析。在GSEA 分析中，選擇來自MSigDB 收集的c2. cp. kegg. v7.0. symbols. gmt 基因集作為參考基因集。錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.25且P＜0.05的聚類被認為差異有統計學意義。

1.5 乳腺癌中TMEM65表達的臨床預后意義

分析TMEM65表達對乳腺癌預后（包括總生存（overall survival，OS）、無進展間隔期（progression free interval，PFI）和 疾 病 特 異 性 生 存（disease specific survival，DSS））的影響，并構建列線圖。

1.6 統計學分析

使用Wilcoxon 秩和檢驗和卡方檢驗對比TMEM65 高低分組之間的臨床病理特征。預后分析采用Kaplan-Meier 分析、單變量和多變量Cox 回歸分析。R 軟件包“rms”用于構建列線圖和校準圖。使用單變量Cox 分析篩選潛在的預后因素（篩選P值為0.1），多變量Cox 分析驗證TMEM65 表達與其他臨床變量對OS、DSS 和PFI 生存的影響。將TMEM65 的表達值與臨床變量相結合，構建列線圖預測3 年、5 年和10 年的乳腺癌OS 率。使用校準曲線和C 指數評估列線圖的效能。所有統計分析均使用R 4.0.2 統計軟件進行。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 根據TMEM65表達中位值分組的臨床病理特征差異

本研究將1 083 例乳腺癌患者根據TMEM65 的表達水平分為高、低兩組，兩組患者之間的臨床特征見表1。結果表明在高、低兩組之間，T分期、N分期、病理分期、年齡、雌激素受體（oestrogen receptor，ER）、孕 激 素 受 體（progesterone receptor，PR）、PAM50 分子分型之間差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 TMEM65高、低表達組之間臨床病理特征比較［n（%）］

2.2 TMEM65在乳腺癌中的表達

基于TCGA 數據庫，測定了TMEM65 在泛癌中的表達情況。如圖1A 所示，在33 種癌癥類型中，TMEM65 在多種癌癥中高表達（P＜0.001），更具體地說，TMEM65 在乳腺腫瘤中的表達在非配對樣本和配對樣本中均高于癌旁組織（P＜0.05，圖1B，1C），在配對樣本中存在統計學差異的概率更大（P＜0.001）。然后根據乳腺腫瘤中TMEM65表達的中位值，將1 083例乳腺癌患者分為高TMEM65表達組和低TMEM65表達組。比較兩組的編碼mRNA表達情況，研究發現，高TMEM65 組中，總共有640 個mRNA（575 個上調，65 個下調）被確認為DEGs（log2FoldChange絕對值＞1.5，P＜0.05），并用火山圖展示（圖1D）。

A：TMEM65在33種癌癥類型中的表達情況； B、C：TMEM65在乳腺腫瘤中的表達在非配對樣本和配對樣本中均高于癌旁組織；D：TMEM65高、低表達組編碼mRNA表達情況的火山圖

2.3 乳腺癌中TMEM65單基因GSEA分析

為了研究TMEM65 在乳腺癌患者中發揮作用的機制，本研究根據TMEM65 中位值將患者分為高、低表達組，然后進行GSEA 分析，如圖2A，2B 所示，研究發現多個乳腺癌相關途徑被富集，包括細胞周期循環，卵母細胞減數分裂，RNA 降解等增殖相關代謝通路富集在高表達組，而在低表達組，主要是花生四烯酸、過氧化物酶體、脂肪酸代謝等多種代謝通路富集。

圖2 TMEM65高、低表達分組的GSEA分析A：高表達組； B：低表達組

2.4 TMEM65表達與臨床病理特征之間的相關性

使用Wilcoxon 秩和檢驗分析TMEM65 在各個臨床病理特征分組之間的表達差異，可見TMEM65在年齡＜60歲，ER、PR陰性，Basal樣乳腺癌亞型（與其它各種亞型相比）患者亞組中均顯著高表達，差異有統計學意義（P＜0.001），見圖3。

A：根據年齡分組； B：根據ER表達水平分組； C：根據PR表達水平分組； D：根據PAM50情況分組； E：根據有無Bssal分組； F：對比LumA和Basal陽性患者； G：對比LumB和Basal陽性患者； H：對比LumA&LumB和Basal陽性患者； I：對比Her2和Basal陽性患者

2.5 TMEM65高表達可能是預后的獨立危險因素

Kaplan-Meier 生存分析表明，TMEM65 高表達與不良OS、DSS 和PFI 顯著相關［分別是風險比（hazard ratio，HR）= 1.71，95%CI：1.23～2.38，P=0.001；HR=2.26，95%CI：1.43～3.59，P=0.001；

HR= 1.50，95%CI：1.07～2.08，P=0.017］，見圖4。單變量Cox 分析表明，高TMEM65 表達與不良OS 率 顯 著 相 關（HR= 1.715，95%CI：1.233～2.386，P=0.001）。多變量Cox 分析證實TMEM65基因高表達是乳腺癌患者OS（HR= 2.123，P＜0.001），DSS（HR= 2.639，P＜0.001）和PFI（HR=1.559，P=0.02）的獨立危險因素，差異有統計學意義，見表2。

圖4 TMEM65在乳腺癌患者中總生存期（overall survival，OS）、疾病特異性生存（disease-specific survival，DSS）、無進展間隔期（progression free interval，PFI）的預后分析A：OS；B：DSS；C：PFI

表2 對乳腺癌患者臨床結局的Cox回歸分析

2.6 構建基于TMEM65表達的列線圖及驗證

通過將TMEM65 的表達與多因素Cox 回歸分析有意義的臨床變量（年齡，N 和M 分期）相結合，構建了3 個列線圖來預測患者的3 年、5 年和10 年OS，DSS 和PFI（圖5A，C，E），C 指數分別為0.7，0.742，0.64。再構建校準曲線測試列線圖的效能（圖5B，5D，5F）?？梢娔Ｐ蜏蚀_性和一致性預測效能很好。

A、C、E：總生存期（overall survival，OS）、疾病特異性生存（disease-specific survival，DSS）、無進展間隔期（progression free interval，PFI）的列線圖；B、D、F：OS、DSS和PFI的列線圖的校正曲線

3 討 論

TMEM65 目前主要在心臟方面研究較多［15-17］，其低表達可能導致一些心臟疾病，但在癌癥中的研究較少，主要在肺癌、前列腺癌和肝癌中被發現作為一個癌基因，另外在一些癌癥預測模型構建中也是一個常見的基因，如前列腺癌［18］、乳腺癌［19］、黑色素瘤［20］、骨肉瘤［21］。說明該基因參與多種腫瘤的發生及發展，但在乳腺癌中尚缺乏系統研究。

本研究主要分析了TMEM65 在乳腺癌患者中的表達和對臨床預后的意義。使用TCGA 數據庫分析了TMEM65在多種人類腫瘤中的表達差異，結果表明TMEM65 基因在多種癌癥中的表達顯著高于其鄰近正常組織。進一步亞組分析表明，TMEM65 主要在年輕、ER 陰性、PR 陰性及Basal 樣亞型乳腺癌患者中顯著高表達，說明TMEM65的表達水平越高，患者的惡性程度可能越高，其中在Basal 亞型顯著高于所有其它亞型（P＜0.001），這是本研究的新發現，表明TMEM65 可能是Basal 亞型乳腺癌的一個特異性腫瘤標志物，而Basal 型乳腺癌在臨床屬于難治性乳腺癌，治療效果很差，復發及死亡率很高，而治療靶點較少，TMEM65 有可能成為一個新的治療靶點，值得進一步探索研究。Kaplan-Meier 生存分析表明，TMEM65 的高表達無論在OS、DSS 還是PFI 方面都是預后差的一個指標，進一步Cox 回歸分析表明，TMEM65 高表達是乳腺癌患者OS、DSS 和PFI 的一個獨立危險因素。最后本研究聯合TMEM65 和多因素Cox 回歸分析有意義的臨床變量構建了預后列線圖模型，其C指數表明模型的區分度很高，校準曲線表明模型預測準確度很高，提示其可以作為一個有價值的預后預測指標，這為臨床醫生個體化預測患者的預后提供了依據，并可以協助醫生制定治療策略。

盡管本研究發現了TMEM65 在乳腺癌中的顯著高表達及其對預后的重要預測價值，但本研究仍然存在一些局限性，如主要關注來自TCGA 數據庫的RNA 測序和臨床數據，缺乏收集臨床標本的驗證。因此，未來將補充體內和體外研究，驗證本研究的結論。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突