高效液相色譜法檢測白酒中四種有機酸的方法研究

張瑞景，王 浩，蔡鳳嬌，夏 燕，汪江波，徐 健*

（1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室 工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068；2.湖北琪譜檢測技術有限公司，湖北 武漢 430068）

白酒是以糧谷為主要原料，以大曲、小曲、麩曲酶制劑及酵母等為糖化發酵劑，經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾、陳釀、勾調而制成的飲料酒[1]，是世界上歷史悠久的六大蒸餾酒之一[2-3]。白酒中的主要成分是乙醇和水，約占總量的98%；微量成分約占總量的2%，包括酯類、酸類、醇類、醛類等成百上千種化合物，這些物質決定了白酒的風格與品質[4]。有機酸類物質約占微量成分的14%～16%，在酒體中起到減輕苦味、增長后味、使酒體豐滿、促進回甜、增加醇和度等作用，是白酒的主要呈味物質，也是酯類物質生成的重要前體物質[5-7]。研究發現，同一有機酸在各香型白酒中的含量存在差異，如乙酸在藥香型原酒中含量高達2.8 g/L、醬香型原酒中含量為1.42 g/L、濃香型原酒中含量僅為0.21 g/L[8]。此外，相同香型白酒的不同樣品中，有機酸的種類和濃度含量也差異較大。李先貴等[9]的研究結果表明，四種典型醬香型白酒中C2～C8的低碳脂肪酸的含量分別為1.7 g/L、1.4 g/L、2.2 g/L和1.8 g/L。張明等[10]對枝江柔雅白酒及其他六種濃香型白酒中的有機酸含量進行檢測，研究表明，白酒中乙酸、乳酸、己酸和丁酸的含量約占總酸含量的90%[6]，是構成白酒中總酸的主要的四種有機酸。因此，準確測定白酒樣品中乙酸、乳酸、己酸、丁酸的含量，對實際生產具有重要的參考及指導作用。

目前，白酒中有機酸的檢測方法主要包括氣相色譜法[11-12]、液相色譜法[13-14]、離子色譜法[15-16]和質譜法[17-18]等。乙酸、丁酸和己酸等揮發性的有機酸多采用氣相色譜法進行測定[19]，但在檢測過程中往往存在峰拖尾的現象[20-21]；非揮發性的有機酸若使用氣相色譜法進行測定還需進行衍生化[17]，處理過程相對繁瑣。宋衛得等[15]采用離子色譜法同時檢測酒樣中的乳酸、乙酸、丁酸等物質，但需先調節樣品pH值至5.2～6.5的范圍內，再將樣品高速離心后進行稀釋，最后經濾膜過濾，收集樣液進行檢測，樣品制備過程相對復雜。乳酸、乙酸、丁酸等也可以用液相色譜法檢測[22-23]，王芳等[24]用液相色譜同時檢測白酒中的四大酸，但是存在基線漂移較大（超過60 mAU）、檢出限高（10 mg/L）的缺點。

本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法同時檢測白酒中乳酸、乙酸、丁酸和己酸四種主要有機酸的含量，對該方法的標準曲線、線性范圍、檢出限、重復性及加標回收率進行了測定。同時，研究了不同乙醇體積分數（1%～70%）對四種有機酸定性和定量的影響，并提出了有效的改良策略。以期得到一種便捷、高效、準確測定白酒中四種有機酸的方法，對實際生產具有一定指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸、丁酸、己酸和乳酸標準品：德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇（色譜級）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甲磺酸（色譜級）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；乙醇（色譜級）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

白酒樣品：均由湖北工業大學釀酒中試基地提供。

1.2 儀器與設備

Thermo U3000 HPLC、Acclaim OA色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：賽默飛世爾科技公司；AS 220.R1電子天平：波蘭RADWAG公司；Direct-Q 5 UV純水儀：美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

分別取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL和7.0 mL無水乙醇置于10 mL的容量瓶中，加入0.5 mL用純水配制的10 g/L四種有機酸母液，用純水定容，得到體積分數1%～70%的乙醇-酸混合溶液。取0.2 mL酒樣用超純水定容至5 mL，搖勻后采用0.22 μm針頭式濾器過濾、備用。

1.3.2 HPLC分析條件

本試驗所用HPLC配備Acclaim OA色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和紫外檢測器，柱溫為25 ℃，檢測波長為210nm，流動相流速為0.8mL/min。流動相包括A：100mmol/L硫酸鈉溶液；B：100%乙腈；C：2.5 mmol/L甲磺酸溶液，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3.3 標準溶液的配制

分別準確量取50 μL乳酸、乙酸、丁酸和己酸標準品于10 mL的容量瓶中，并置于電子天平上稱質量，用10%乙醇溶液定容，得到四種有機酸標準溶液的母液。分別量取0.02 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL和0.8 mL母液置于10 mL的容量瓶中，用純水定容得到不同質量濃度（8～430 mg/L）混標，經0.22 μm針頭式濾器過濾，4 ℃保存備用。

1.3.4 方法的精密度試驗

參考GB/T 6379.3—2012/ISO 5725-3：1994《測量方法與結果的準確度（正確度與精密度）第3部分：標準測量方法的中間度量》[25]的方法進行，按1.3.2的實驗方法，每個樣品重復測量6次，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 加標回收率試驗

向本底值約為100 mg/L的標樣中分別加入約40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L和240 mg/L的標樣，按1.3.2的方法進行測量，每個樣品重復測量6次。計算標樣加標回收率。

取0.1 mL白酒樣品置于5 mL的容量瓶中，分別加入不同濃度的標樣，用超純水定容，搖勻后經0.22 μm針頭式濾器過濾后備用，按照1.3.2的方法進行測量，計算樣品加標回收率。

1.3.6 白酒樣品中總酸含量的測定

白酒樣品中總酸含量的測定參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[26]進行。

1.3.7 數據處理

根據標準溶液的濃度及由HPLC測得的對應峰面積，通過Thermo U3000 HPLC自帶的Chromeleon 7軟件擬合得到標準曲線及相關系數，并用該軟件進行平均值、RSD的計算。用Excel 2010進行回收率的計算。

2 結果與分析

2.1 四種有機酸的定性

在前期試驗中，通過對比乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、2.5 mmol/L甲磺酸-乙腈、100 mmol/L Na2SO4-2.5 mmol/L甲磺酸-乙腈等不同流動相組合，結果發現，采用100 mmol/L Na2SO4-2.5 mmol/L甲磺酸-乙腈流動相體系時，乳酸、乙酸、丁酸和己酸都能較好的分離（分離度均＞1.5），如圖1所示，四種酸的峰形較為對稱、尖銳。此外，四種酸類物質能夠在25 min內全部出峰，檢測時間較短。

圖1 四種有機酸混合標準溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of four organic acids mixed standard solution

2.2 線性關系及檢出限

采用1.3.2的方法對配制的不同質量濃度的系列標準溶液進行檢測，用Chromeleon7軟件對測得的峰面積（y）和質量濃度（x）擬合得到標準曲線。四種有機酸的保留時間、線性范圍、標準曲線回歸方程、相關系數及檢出限見表2。

表2 四種有機酸HPLC分析的保留時間、線性范圍、標準曲線回歸方程、相關系數及檢出限Table 2 Retention time,linear range,standard curve regression equation,correlation coefficient and limit of detection of four organic acids analyzed by HPLC

由表2可知，四種有機酸標準曲線的相關系數R2均＞0.999 7，能達到GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》[27]的技術要求，說明該方法線性良好，可滿足定量檢測的要求。參考GB/T 5009.1—2003《食品衛生檢驗方法理化部分 總則》[28]以信噪比（S/N）=3確定檢出限，除丁酸外檢出限均在1 mg/L以下，能夠滿足實驗室的檢測需求。

2.3 方法的精密度試驗

選取17～19 mg/L、120～160 mg/L及245～315 mg/L三個質量濃度范圍的標樣，用1.3.2的方法進行6次平行測定，計算四種有機酸在不同質量濃度下的測定結果的平均值及RSD，結果見表3。

表3 精密度試驗結果（n=6）Table 3 Results of precision tests (n=6)

由表3可知，當乙酸、丁酸和己酸的質量濃度較低（17～19 mg/L）時，RSD在0.53%～1.54%之間，在中、高質量濃度（124～313 mg/L）時，RSD＜0.5%，在高質量濃度時的重復性比低質量濃度時好；乳酸在三種不同質量濃度下RSD均＜0.3%。四種有機酸的精密度試驗結果相對標準偏差均＜1.6%，說明該方法的精密度良好，可用于白酒樣品的檢測。

2.4 方法加標回收率試驗

在本底值約為100 mg/L的標樣中，依次進行四個不同質量濃度添加水平下的回收率實驗，每個樣品平行測定3次，計算平均回收率和RSD，結果如表4所示。

表4 加標回收率試驗結果（n=3）Table 4 Results of adding standard recovery rate tests (n=3)

續表

由表4可知，乳酸的加標回收率在97.24%～100.75%之間，乙酸的加標回收率在98.51%～104.34%之間，丁酸的加標回收率在98.71%～103.54%之間，己酸的加標回收率在100.07%～104.40%之間，四種有機酸的加標回收率均能達到GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》[27]的技術要求，RSD均＜0.5%，表明該方法的測定結果準確度較好。

2.5 乙醇體積分數對四種酸出峰效果的影響

白酒中乙醇的含量較高，體積分數在25%～68%之間[29-30]。乙醇由于比水、乙腈、甲醇等常用流動相的極性弱，因此在反相色譜系統中有著更強的洗脫力[31]。在選用水-乙腈作為流動相的反相色譜系統中，乙醇的存在可能會對樣品中四種有機酸的保留時間造成影響，進而影響酒樣中四種有機酸的定性及定量。研究不同乙醇體積分數對乳酸、乙酸、丁酸和己酸保留時間、峰形的影響，其結果如圖2和表5所示。

表5 不同乙醇體積分數對丁酸、己酸保留時間的影響Table 5 Effect of different alcohol volume fraction on the retention time of butyric acid and hexanoic acid

圖2 不同乙醇體積分數對乳酸、乙酸保留時間及色譜峰的影響Fig.2 Effect of different alcohol volume fraction on the retention time and chromatographic peak of lactic acid and acetic acid

由圖2可知，不同乙醇體積分數對乳酸和乙酸的保留時間影響較大，乙醇體積分數在30%以上時，兩種有機酸不能有效分離且所得峰形較差。乙醇體積分數在5%和20%時，乳酸和乙酸可以分開，但是乙酸峰形較差，且兩種有機酸的保留時間與標樣相比提前0.15 min以上。當乙醇體積分數＜3%時，乳酸和乙酸的峰形與標樣相比變化較小，保留時間與標樣相比差值在0.1 min以內，兩種有機酸的定性和定量基本不受影響。

由表5可知，不同乙醇體積分數對丁酸、己酸保留時間的影響較小，當乙醇體積分數從1%提高至70%時，兩種酸的保留時間幾乎沒有變化（RSD＜0.1%），這表明該方法中己酸和丁酸的定性定量不受乙醇體積分數的影響。因此，對于只需測定己酸或丁酸的白酒樣品可不用稀釋，經0.22 μm濾膜過濾后直接進行檢測。在用此方法同時測定四種有機酸時，由于白酒中乙醇體積分數較高，尤其是高度酒乙醇體積分數通常在40%以上[29]，需要對白酒樣品進行稀釋處理，將乙醇含量控制在3%以下。

2.6 白酒樣品的測定

分別準確量取0.2 mL的濃香型、醬香型和清香型白酒樣品置于5 mL容量瓶中，用超純水定容，經0.22 μm濾膜過濾后，按1.3.2的色譜條件進行四種有機酸的檢測，結果見表6。

由表6可知，在三種酒樣中四種有機酸的含量占總酸的89%以上，是其主要的有機酸，且由于3種酒樣香型不同，四種有機酸在各酒樣中的含量差異較大。酒樣1為濃香型白酒，己酸是主體香味成分己酸乙酯的前體物質之一，其含量與己酸乙酯含量呈正相關[32]，在此樣品中己酸含量達到0.9 g/L，在四種酸中含量最高；乳酸含量達到0.8 g/L，處于較高水平，說明該酒較好[5]；乙酸含量相對較低。酒樣2為醬香型白酒，該酒中乙酸的含量最高，達到1.2 g/L，占總酸含量的70%以上；其次為乳酸，含量為0.36 g/L。酒樣3為清香型白酒，乙酸是主體香味成分乙酸乙酯的前體物質之一，含量達到0.9 g/L，占總酸含量的一半以上；乳酸含量為0.4 g/L，同樣是該酒樣主要的酸類物質之一。三種酒樣的測定結果與其香型特點相符。上述結果表明，該方法能準確檢測出各酒樣間同一有機酸含量的區別及同一酒樣中不同有機酸含量的差異。

表6 不同酒樣的測定結果Table 6 Determination results of different Baijiu samples by HPLC

3 結論

本研究建立了高效液相色譜法同時測定白酒中乳酸、乙酸、丁酸和己酸含量的方法，其標準曲線相關系數、精密度、加標回收率均能達到GB/T 27404—2008的技術要求。通過研究不同體積分數乙醇對四種有機酸保留時間和峰形的影響，發現在實際檢測中將白酒樣品的乙醇體積分數稀釋至3%以內，可以提高檢測結果的準確性。采用該方法對三種不同白酒樣品中的四種有機酸進行測定，可準確檢測出各酒樣中乳酸、乙酸、丁酸和己酸的含量差異。本研究所提出的方法可用于不同白酒樣品中四種有機酸含量的檢測，能快速、準確的獲得結果，對白酒的勾調具有重要的指導意義。