基于小RNA測序的甜櫻桃病毒種類檢測及鑒定

趙志惠，李豐，朱天生*，高瑞，孫玉剛

(1.塔里木大學植物科學學院/南疆農業有害生物綜合治理兵團重點實驗室/南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室，新疆阿拉爾 843300；2.山東省果樹研究所，山東泰安 271000)

櫻桃病毒病是威脅甜櫻桃產業發展的重要病害，感病后其產量和品質顯著下降，嚴重阻礙了櫻桃產業的可持續發展。目前，已報道侵染核果類果樹的病毒至少有29種[1]，其中，李屬壞死環斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus， PNRSV)[2-4]、李矮縮病毒(Prunusdwarfvirus， PDV)[4-6]、蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus， ACLSV)[6]、櫻桃銼葉病毒(Cherryraspleafvirus， CRLV)[7]、櫻桃病毒 A(CherryvirusA， CVA)[8]、櫻桃綠環斑駁病毒(Cherrygreenringmottlevirus， CGRMV)[9]和櫻桃小果病毒2(Littlecherryvirus2， LChV2)[10]等是甜櫻桃上發生最普遍、危害較為嚴重的病毒。

常規植物病毒病害的檢測方法主要有指示植物法、電子顯微鏡技術、酶聯免疫吸附法(ELISA)和分子生物學技術等。阮小鳳等利用酶聯免疫吸附法在甜櫻桃上檢測到了李屬壞死環斑病毒、李矮縮病毒、蘋果褪綠葉斑病毒及蘋果花葉病毒等病毒[6]。王文文等通過分子生物學技術首次在環渤海灣地區檢測出櫻桃小果病2和櫻桃病毒病A復合侵染，復合檢測率為37.3%[11]。周攀登等通過多重RT-PCR方法檢測到櫻桃病毒的復合侵染[12]。這些方法在已知病毒引起的病毒病害檢測上針對性強，但對于新病毒的發現較為困難，而高通量測序技術則是對小RNA進行測序，并組裝和注釋來檢測病毒和發現新病毒，用于病毒病害鑒定具有巨大優勢，不易出現漏檢和錯檢現象[13]。利用高通量測序技術賴丁王等首次在南繁區水稻樣品中檢測到水稻黃矮病毒[14]；辛敏等在河南開封西瓜病毒病樣品中檢測出3種未知RNA病毒[15]；洪怡等發現納雍地區瑪瑙紅櫻桃病毒病主要是櫻桃小果病2[13]。

土耳其研究者早在2008年發現啤酒花矮化類病毒(Hopstuntviroid，HSVd)侵染甜櫻桃和酸櫻桃，國內2017 年首次報道在表現斑果病(Dapple fruit)癥狀的紅燈甜櫻桃中檢測到了啤酒花矮化類病毒，并發現在山東、遼寧和山西等甜櫻桃產區普遍存在。甜櫻桃斑果病在果實上的癥狀與“花臉”癥狀相似，雖然檢測到了啤酒花矮化類病毒的存在[16]，但未明確表現該癥狀果實中病毒的種類。筆者通過對2個表現“花臉”癥狀的甜櫻桃樣品進行小RNA測序，明確了甜櫻桃“花臉”病的主要病毒種類，為甜櫻桃病毒病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

表現“花臉”癥狀的2個甜櫻桃采自山東省煙臺市福山區，品種均為美早。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及檢測 將采集的2個“花臉”癥狀甜櫻桃樣品分別編號YT-1和YT-2，取適量樣品加入液氮研磨至粉末狀，并按照植物總RNA提取試劑盒TRIzol說明書提取總RNA。將提取到的RNA進行質量、濃度、純度及完整性檢驗。

1.2.2 小RNA測序 選擇質量合格的總RNA送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行小RNA深度測序。使用Small RNA Sample Pre Kit構建文庫，直接在小RNA兩端加上接頭，然后反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，PAGE膠電泳分離目標DNA片段，切膠回收得到cDNA文庫。使用Agilent對得到的cDNA文庫進行insert size檢測，符合預期后使用q-PCR對文庫有效濃度進行準確定量。文庫檢測合格后，上機進行HiSeq/MiSeq測序。

1.2.3 數據過濾及18～26 nt的小RNA篩選 將測序得到的raw reads進行處理和過濾，并富集長度主要是21 nt，22 nt和24 nt的siRNAs。對過濾得到的clean reads，篩選長度18～26 nt的小RNA來進行分析。

1.2.4 病毒種類篩選 利用Velet對獲取的小RNA進行組裝，并與寄主基因數據庫進行比對，除去寄主基因組序列。將去除寄主基因序列后的contigs用blastx與核酸數據庫進行比對，尋找與contigs高度同源的序列。未比對到的則與蛋白質數據庫進行比對，尋找部分同源序列。將尋找到的高度同源序列和部分同源序列分別與病毒核苷酸數據庫和蛋白數據庫進行比對，篩選出與病毒序列同源的contigs，評估為候選病毒。

2 結果與分析

2.1 癥狀表現

2株感病的甜櫻桃葉片無明顯癥狀表現，果實表現為著色不均勻，表面不平滑，表現為“花臉”癥狀(圖1)。

圖1 感病植株果實表現癥狀

2.2 小RNA測序數據統計

測序數據表明，YT-1和YT-2兩個文庫測序結果分別獲得原始讀數(raw reads)14 190 241條和14 954 849條，過濾掉低質量、污染讀數后，獲得clean reads分別為13 485 830條和14 408 784條，其clean reads與raw reads的比例均95%以上，符合后續數據分析要求(表1)。

表1 小RNA高通量測序數據質量統計

2.3 18～26 nt長度的小RNA條數

YT-1 和YT-2樣品獲得小RNA長度在18～26 nt分布有7966 682條和11 123 054條(表2)。小RNA長度主要集中在20～24 nt，YT-1樣品以22 nt和24 nt占比較高，22 nt小RNA占篩選總數的12.77%，24 nt小RNA占篩選總數的32.95%；YT-2樣品以20 nt和24 nt占比較高，20 nt小RNA占篩選總數的17.29%，24 nt小RNA占篩選總數的30.66%(圖2)。

表2 18～26 nt小RNA的條數

圖2 小RNA序列長度分布

2.4 小RNA的拼接與注釋

對篩選所獲得的18～26 nt小RNA進行拼接，YT-1和YT-2分別獲得3 202條和2 430條contigs。YT-1樣品在病毒核酸數據庫和病毒蛋白數據庫分別注釋到91條和147條contigs；YT-2樣品在病毒核酸數據庫和病毒蛋白數據庫分別注釋到54條和84條contigs(表3)。

表3 感病甜櫻桃小RNA在數據庫的contig注釋數量

2.5 候選病毒

YT-1樣品中鑒定到6種候選病毒，其中與櫻桃小果病毒2(LChV2)同源的contigs最多，為52 539條，占總候選病毒的55.12%；其次是李屬壞死環斑病毒(PNRSV)，為21 185條，占總候選病毒22.23%；與櫻桃病毒A(CVA)同源的contigs有12 759條，占總候選病毒的13.39%；與李樹皮壞死莖紋孔伴隨病毒(Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus， PBNSPaV)同源的contigs為7 133條，占7.48%；與櫻桃綠環斑駁病毒(CGRMV)同源的contigs為1 618條，占1.70%；啤酒花矮化類病毒(HSVd)有82條，占0.08%。

YT-2樣品中鑒定到4種候選病毒，其中李屬壞死環斑病毒(PNRSV)同源的contigs最多，為70 781條，占總候選病毒的59.05%；其次是櫻桃病毒A(CVA)，為37 636條，占總候選病毒31.40%；與李樹皮壞死莖紋孔伴隨病毒(PBNSPaV)同源的contigs有7 371條，占總候選病毒的6.15%；與櫻桃綠環斑駁病毒(CGRMV)同源的contigs為4 083條，占3.40%(表4)。

表4 感病甜櫻桃病毒種類鑒定

3 小結與討論

本研究通過對2個表現“花臉”癥狀的甜櫻桃樣品進行高通量測序，結果表明，樣品YT-1檢測到了LChV2、PNRSV、CVA、PBNSPaV、CGRMV及HSVd等6種病毒的復合侵染，而樣品YT-2檢測到了PNRSV、CVA、PBNSPaV及CGRMV等4種病毒的復合侵染。

甜櫻桃病毒病發生嚴重且多以復合侵染為主，如PNRSV常與PDV或蘋果花葉病毒(Applemosaicvirus，ApMV)一起發生，造成果園減產[6,17]；CVA與LChV 2的病毒復合侵染使果實產量與品質明顯下降[11,18]。2018年曹欣然等對山東省甜櫻桃病毒病進行調查及鑒定，發現山東省甜櫻桃病毒病發生嚴重，病毒檢測率高達84.5%，其中主要以復合侵染為主，病毒復合侵染率為96.6%[19]。王文文等和劉聰利等研究表明，復合侵染病毒種類不同，癥狀表現也不同，且癥狀與病毒種類之間無明顯關系[20,21]。在甜櫻桃上，同時感染PNRSV、PDV、CVA、CGRMV及LChV 2表現為褪綠斑駁和黃綠相間帶紋兩種不同癥狀[19]；PNRSV、PDV、CVA病毒復合侵染表現為葉片細長、濃綠或葉片褪綠斑駁兩種癥狀[21]；同時感染PNRSV、CGRMV、CVA病毒或PNRSV、PDV、CGRMV、CVA病毒葉片均表現出壞死環斑癥狀[21]。在本研究中，兩個樣品均表現“花臉”癥狀，但檢測到復合侵染病毒種類不同，僅在YT-1樣品種檢測到類病毒HSVd?！盎槨卑Y狀與類病毒HSVd 在紅燈甜櫻桃上引起的“Dapple fruit”癥狀相似，因此需進一步研究在甜櫻桃上HSVd的侵染和癥狀表現的關系，為甜櫻桃病毒病的防控提供參考。