五氯硝基苯影響大鼠卵泡發育的機制研究

淡清華，駱海燕，張雨彤，高小博，陸彩玲*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所遺傳優生中心，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100005)

卵泡是卵巢的基本結構與功能單位，每個卵泡由一個卵母細胞及周圍包裹的顆粒細胞和外層的卵泡膜包裹而成。根據Pedersen等[1]對卵泡的描述，卵泡發育分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇卵泡四個階段。原始卵泡一般處于休眠中，只有少數原始卵泡被激活發展到竇卵泡階段進一步排卵，大部分卵泡會發生閉鎖[2]。卵泡生長期包括顆粒細胞增殖、分化和卵母細胞生長等過程，卵泡的成熟主要是在促性腺激素誘導下通過顆粒細胞介導調控[3]。多條信號通路參與卵泡發育的調控，包括磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號通路和MAPK信號通路等[4]。PI3K-AKT信號通路主要在原始卵泡向初級卵泡發育階段發揮作用，加速原始卵泡的募集[5]。PI3K是細胞內重要的信號轉導分子，它將下游的AKT招募到細胞膜上，通過傳導信號促進卵泡的存活、生長和卵母細胞活化[6-7]。張力蛋白同源物(PTEN)是具有磷酸酶活性的抑癌基因[8]，McLaughlin等[9]研究發現PTEN抑制劑導致PI3K-AKT通路過度激活，促進AKT磷酸化，加速原始卵泡發育。MAPK信號通路主要參與卵泡發育中顆粒細胞的分化，高濃度的cAMP激活細胞內蛋白激酶A(PKA)，PKA 繼而轉錄激活目的基因，合成特異性蛋白，促進顆粒細胞增殖[10-11]。

環境內分泌干擾物(EDCs)是一類具有干擾內環境平衡及生殖發育過程的外源性物質，包括農藥、工業化學物質等環境污染物[12]。五氯硝基苯(PCNB)是一種具有EDCs性質的有機氯農藥，廣泛應用于農業生產的拌種、殺菌及花草樹木的病蟲防害[13]。PCNB化學性質穩定，難降解，通過食物鏈的傳播長期暴露于食物供應和飲水中，對動物的生殖系統有毒性作用[14]。Arora等[15]研究發現口服PCNB的孕鼠在其后代中表現出腭裂以及胎兒死亡率升高等。王新[16]報道PCNB對小鼠睪丸產生毒性和氧化損傷作用，精子畸形率增加，引發生殖健康風險。我們實驗室前期報道PCNB能改變青春前期大鼠卵巢甾體激素的合成水平，加速原始卵泡的發育[17-18]。在此我們探索PCNB影響青春前期大鼠卵泡發育的分子機制。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物：SPF級青春前期雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，21日齡，體重55～60 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，于國家衛生健康委科學技術研究所實驗動物中心飼養，許可證號：SCXK(京)2016-0006。動物室溫度22～24℃，空氣相對濕度50%～70%，12 h晝/夜循環照明，保證大鼠充足的食水。所有實驗均通過國家衛生健康委科學技術研究所動物倫理委員會批準(倫理批號2016-017)。

2.主要試劑和設備：五氯硝基苯(Sigma，美國)；玉米油(阿拉丁，中國)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo，美國)；P-AKT兔抗鼠單克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國)；AKT兔抗鼠單克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國)；PTEN兔抗鼠單克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國)；β-actin小鼠抗人單克隆抗體(Thermo，美國)；山羊抗兔/小鼠IRDye-800CW二抗(LI-COR，美國)；超聲波細胞粉碎機(Branson SLP，美國)；全自動酶標儀(Bioteck，美國)；紅外激光掃描成像系統(LI-COR，美國)；Real-Time PCR System PCR儀(ABI，美國)；倒置生物顯微鏡(Nikon，日本)；低溫高速離心機(Biotool，瑞士)；Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，美國)。

二、研究方法

1.動物分組及染毒：將14只21日齡雌性SD大鼠隨機分為對照組和實驗組，每組7只。實驗組采用PCNB(100 mg·kg-1·d-1)灌胃給藥，對照組給予等體積玉米油。每日1次，連續7 d。

2.動物一般情況觀察：包括精神狀態、進食、活動情況。每天測量大鼠體重，根據體重調整用藥劑量。最后一次染毒24 h后，用戊巴比妥鈉麻醉后取血保存于普通真空采血管中，待大鼠安樂死后，分離雙側卵巢，去掉筋膜與脂肪組織，電子天平稱卵巢重，得出卵巢系數 [卵巢系數(%)=卵巢濕重(mg)/體重(g)×100%]。一側卵巢置于10%甲醛溶液中固定，另一側卵巢置于液氮罐備用。

3.蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各級卵泡：卵巢在10%甲醛溶液中充分固定72 h后進行脫水，卵巢組織切片，常規HE染色，光學顯微鏡下觀察。以每個卵巢切面上不同發育階段卵泡數各占整個卵巢切面上總卵泡數的百分比表示各級卵泡的發育情況。卵泡分級參照文獻分類方法[1]：原始卵泡由一個中央的卵母細胞和單層扁平的顆粒細胞組成；初級卵泡由中央的卵母細胞及周圍單層的立方狀顆粒細胞組成；次級卵泡的卵母細胞被2層或者2層以上的顆粒細胞包圍，沒有形成竇腔；竇卵泡中包含2層或者2層以上的顆粒細胞，有竇腔形成。生長卵泡總數是初級卵泡數、次級卵泡數和竇卵泡數之和。

4.卵巢組織樣品RNA-Seq測序：對照組與實驗組分別選取2個卵巢組織樣本，進行 RNA 提取，利用Agilent 2100生物分析儀對組織樣品RNA的完整性進行評估，RNA完整性系數≥7的樣本用于后續分析。根據制造商的說明書，使用TruSeq鏈式mRNA構建文庫。然后在Illumina測序平臺上對文庫進行測序。

利用 DESeq軟件[19]對不同樣本基因的counts數目進行標準化處理(采用BaseMean值來估算表達量)，計算差異倍數，并采用負二項分布檢驗的方式(NB)對reads數進行差異顯著性檢驗，最終根據差異倍數(Fold change值)及差異顯著性檢驗結果q值(Pvalue值)來篩選差異蛋白編碼基因。篩選對應差異表達基因(|log2 Fold change|>2，q<0.05)的GO 條目和pathway條目，并用超幾何分布檢驗的方法分析GO和KEGG富集分析，以校正后的q<0.05為閾值，滿足此條件的GO詞條和KEGG通路被認為具有顯著性。

5.卵巢組織蛋白質提取定量及Western blot檢測：切取部分大鼠卵巢組織，加入組織裂解液及蛋白酶抑制劑，超聲粉碎后冰上繼續裂解30 min。4℃、13 000 r/min離心15 min，收集上清，利用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。蛋白變性后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)稀釋的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用一抗(P-AKT；AKT；PTEN；β-actin)4℃孵育過夜；PBST洗膜后加入二抗室溫孵育1 h；最后用紅外激光掃描成像系統顯示目的條帶，ImageJ軟件分析蛋白灰度值。

三、統計學分析

結 果

一、PCNB對大鼠生長及卵泡發育的影響

青春前期雌性SD大鼠連續灌胃7 d，對照組和實驗組大鼠毛發、體形及精神狀態均無明顯異常。體重測量結果顯示，與對照組相比，實驗組大鼠體重增長無顯著性差異(P>0.05)(圖1 A)。與對照組相比，實驗組卵巢系數輕微增加，但無顯著性差異(P>0.05)(圖1 B)。HE染色與卵泡計數結果顯示，與對照組相比，實驗組大鼠的原始卵泡數量顯著減少(P<0.05)，生長卵泡的數量顯著增加(P<0.01)，而卵泡總數沒有明顯變化(P>0.05)(圖1C、D、E和F)。這些結果表明PCNB加速了青春前期SD大鼠原始卵泡的發育，與我們前期報道[18]相符。

A：大鼠體重；B：卵巢系數；C：HE染色(標尺=1 000 μm)；D：總卵泡數；E：原始卵泡占總卵泡數的百分比；F：生長卵泡占總卵泡數的百分比。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 PCNB處理后大鼠體重、卵巢系數及卵泡數目的變化情況

二、PCNB對大鼠卵巢組織基因表達情況的影響

為了探究PCNB影響大鼠卵巢卵泡發育的分子機制，我們將對照組和實驗組的大鼠卵巢組織進行RNA-Seq分析，根據蛋白編碼基因的表達量進行差異篩選，檢測到差異基因數量共有261個(|log2 Fold change| >1，q<0.05)。與對照組相比，實驗組共有62個基因表達顯著上調，199個基因表達顯著下調(圖2A)。差異分布火山圖和差異基因聚類分析結果顯示，PCNB暴露引起大鼠卵巢組織內基因表達發生顯著改變，其中差異表達幅度排在前10位的上調基因包括Kcne2、Lect1和Rho等，下調基因包括Aqp4、Elf3和Pigr等(圖2B和2C)。

A：差異表達基因統計柱狀圖；B：差異基因表達火山圖；C：差異基因分組聚類圖(標注出差異表達幅度排在前10位的上調基因和下調基因)。|log2 Fold change| >1，q<0.05。圖2 PCNB處理后大鼠卵巢組織差異基因分布情況

三、大鼠卵巢組織差異表達基因的 GO分析和KEGG富集分析

GO分析結果顯示，差異表達基因主要富集在細胞分化、蛋白磷酸化、細胞內信號轉導及ATP結合的微管裝配等(圖3A)。KEGG 富集條目結果顯示，差異表達基因主要富集在PI3K-AKT信號通路、cAMP信號通路及MAPK信號通路上，其中富集到PI3K-AKT信號通路的差異基因數量較多(圖3B)。綜合KEGG結果分析，提示PCNB對大鼠卵巢PI3K-AKT信號通路的影響更為明顯。

A：GO富集分析展示圖；B：KEGG富集分析氣泡圖。圖3 PCNB處理大鼠卵巢組織內差異表達基因的生物學功能及分子信號通路的富集情況

四、PCNB對大鼠卵巢PI3K-AKT通路的影響

為了確定PCNB對PI3K-AKT通路的調控，我們檢測了大鼠卵巢AKT的磷酸化水平及PTEN的表達。Western Blot結果顯示，與對照組相比，實驗組AKT磷酸化水平顯著增加(P<0.05)，PTEN蛋白表達水平顯著減少(P<0.05)(圖4)，表明PCNB抑制PTEN的表達，激活PI3K-AKT信號通路。

A：Western Blot檢測；B：蛋白相對表達水平柱狀圖(以對照組為1標準化)。與對照組比較，*P<0.05圖4 PCNB處理后P-AKT及PTEN的蛋白表達情況

討 論

我們前期報道PCNB改變青春前期大鼠卵巢內甾體激素孕酮合成，加速原始卵泡發育[18]。本研究我們主要對PCNB暴露影響大鼠卵泡發育的分子機制進行探究。

卵泡發育受多種生長因子和信號通路的復雜調控。為了探究PCNB影響大鼠卵巢卵泡發育異常的分子機制，我們將對照組和PCNB實驗組的大鼠卵巢組織通過RNA-seq測序篩選的差異表達基因進行GO分析，發現差異表達基因主要富集在細胞分化、蛋白磷酸化和細胞內信號轉導等，特別是在微管裝配上富集較多，可能與細胞內物質運輸或細胞分裂過程中微管的組裝有關。KEGG 富集分析結果顯示，差異表達基因富集的分子信號通路主要包括PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路和cAMP信號通路等，其中PI3K-AKT信號通路富集的差異基因數目相對較多。PI3K-AKT信號通路是卵泡發育早期的關鍵通路，調節原始卵泡的活化和生長[20]。Hannon等[21]報道工業污染物鄰苯二甲酸單乙基己基酯通過過度激活PI3K信號通路加速了體外培養小鼠整個卵巢內早期卵泡的發育。趙倩[22]發現雙酚A主要通過過度激活PI3K-AKT信號通路發揮促進原始卵泡發育的作用。結合我們的測序和生物信息學分析結果，提示PCNB可能影響PI3K-AKT信號通路調控卵泡發育。

為了確定PCNB對PI3K-AKT通路的影響，Western blot結果顯示實驗組較對照組AKT的磷酸化蛋白水平顯著增加(P<0.05)，PTEN蛋白表達水平顯著減少(P<0.05)。PTEN是PI3K-AKT信號通路的負調控因子，Reddy等[23]發現敲除PTEN的小鼠原始卵泡加速生長，導致原始卵泡池的早期耗盡。Jagarlamudi等[24]通過特異性敲除初級卵泡和生長卵泡卵母細胞中的PTEN發現，PI3K通路下游信號AKT磷酸化水平增加，加速原始卵泡的募集。我們的研究結果表明PCNB抑制PTEN的表達，激活PI3K-AKT通路，提示PCNB可能通過激活PI3K-AKT通路加速了大鼠原始卵泡的發育。MAPK信號通路主要參與促性腺激素誘導下卵巢顆粒細胞的增殖調控，促進卵泡的成熟[10]。在我們前期報道中，PCNB激活大鼠原代顆粒細胞和卵巢組織有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK3/1)信號通路[18]。另外已有研究證明MAPK信號通路參與大鼠原始卵泡的活化與生長，Zhao等[25]用MAPK3/1信號抑制劑培養新生鼠卵巢，發現原始卵泡數量減少。這些數據提示除了PI3K-AKT信號通路，MAPK通路也參與了PCNB對大鼠卵泡發育的影響。

有機氯農藥具有內分泌干擾活性，可長時間殘留在土壤及食品中，殘留的農藥本身和代謝產物可能會危害生物體的健康[26-27]。有機氯農藥PCNB進入體內可代謝為五氯苯酚、五氯苯胺和甲基五氯苯基硫醚等多種產物。其中五氯苯酚可干擾類固醇受體導致雌魚激素紊亂和性腺退化等不良反應[28]。有研究發現五氯苯酚暴露加速雌性虹鱒魚卵母細胞發育，減少了可排卵的細胞數量[29]。提示PCNB對大鼠卵巢發育和功能的干擾可能也與其代謝物五氯苯酚有關。

綜上所述，PCNB處理激活PI3K-AKT信號通路，抑制PTEN的蛋白表達，加速了大鼠原始卵泡發育。我們的研究初步闡述了PCNB暴露影響青春前期大鼠卵泡發育的分子機制，為基于毒理機制的PCNB生殖健康風險評估提供了實驗依據。