頭孢菌素的聚合物分析

胡昌勤 張夏 李進

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

對藥物雜質譜(impurity profile)的控制一直是當前國內外藥品質量控制的關注熱點[1-2]。β-內酰胺抗生素主要包括青霉素和頭孢菌素兩大類，頭孢菌素作為臨床中最重要的一類β-內酰胺抗生素，是當前國內仿制藥一致性評價的熱點品種。針對β-內酰胺抗生素雜質譜控制中的最薄弱環節——聚合物控制問題[3]，作者已經對青霉素類抗生素聚合物分析的進展進行了綜述[4]，也對頭孢菌素中7-氨噻肟頭孢菌素的聚合物分析策略與方法進行了專門的討論[5]。鑒于頭孢菌素的聚合反應與其3位側鏈和7位側鏈的結構密切相關，根據頭孢菌素7位側鏈的特點，將其分為7位側鏈含有伯氨基的頭孢菌素(7-氨噻肟頭孢菌素是其中的一類)和不含伯氨基的頭孢菌素；根據其3位側鏈的特點，將其分3位側鏈為烷基結構和具有易解離基團的頭孢菌素(圖1)；然而，實際產品中7位側鏈不含有伯氨基結構且3位側鏈為烷基結構的頭孢菌素較少存在。本文通過對近年來文獻[6-11]的回顧性分析，將分別對7位側鏈含有伯氨基的頭孢菌素(不包括7-氨噻肟頭孢菌素)和7位側鏈不含有伯氨基但3位側鏈具有易解離基團的二類頭孢菌素的聚合物分析進展進行總結。

1 7位側鏈具有伯氨基結構的頭孢菌素

7位側鏈含有伯氨基結構的頭孢菌素，除7-氨噻肟頭孢菌素外，目前臨床中主要有頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢克洛、頭孢丙烯和頭孢拉定。該類頭孢菌素的3位側鏈較為穩定，不易發生降解反應；7位側鏈結構與青霉素中氨芐西林、阿莫西林的6位側鏈結構相似；故認為它們的聚合反應與氨芐西林、阿莫西林的聚合反應相似。根據對氨芐西林、阿莫西林聚合反應的認知[4,12]，其主要聚合反應途徑為氨基攻擊β-內酰胺環聚合，其他可能的聚合反應即使在強制聚合反應中也較難發生；雖然氨基與β-內酰胺環的聚合可以形成多種差異異構體，但在實際產品中通常僅存在一個主要的異構體，其他異構體的含量較低可以忽略。以頭孢氨芐為例，在中國藥典2015版頭孢氨芐有關物質色譜系統中，通過調整有機相比例使頭孢氨芐的保留時間約為5 min，主峰后可見5個主要雜質峰；利用柱切換-LC/MS/MSn技術證明其中3個雜質峰(MP-1、IMP-2和IMP-3)的分子量均為694.8 Da，質譜裂解信息也基本相同，提示它們為頭孢氨芐二聚體差向異構體；其中MP-1的含量最高，是主要聚合產物[6]；與對氨芐西林、阿莫西林的聚合分析結果[4]相似。

對聚合物質譜裂解信息的解析是聚合物分析中的重要環節，掌握頭孢菌素的質譜裂解規律有助于對聚合物質譜裂解途徑的推斷。該類頭孢菌素典型的質譜裂解規律見圖2A[13]，據此，可以較好地解釋頭孢氨芐二聚體二級質譜圖中的主要碎片離子(圖2B～C)；而通過高分辨質譜(HRMS)確定頭孢氨芐二聚體的精確分子量，分析其元素組成(C32H35O8N6S2+)，并與所推測結構的理論分子量相比較(誤差僅差-1.384 ppm)，可進一步確證所推測的頭孢氨芐二聚體結構的正確性[6]。

采用高效凝膠色譜(HPSEC)-柱切換-LC/MS方法，分析頭孢拉定在非水溶液強制聚合中形成的聚合物雜質[7]：在HPSEC的HPSEC-2和在HPSEC-3色譜峰中均發現頭孢拉定二聚體(MW698.2)；柱切換分析顯示它們在RP-HPLC中呈3個色譜峰，與頭孢氨芐二聚體相似；此外，在HPSEC-4和HPSEC-5色譜峰中分別發現頭孢拉定三聚體(MW1047.6)和頭孢拉定四聚體(MW1396.8)，但它們在RP-HPLC中均不呈尖銳的色譜峰，提示在HPSEC色譜峰中可能為多個差向異構體的混合物。質譜分析顯示，頭孢拉定二聚體的質譜裂解途徑與頭孢氨芐二聚體相似；頭孢拉定三聚體在質譜分析中產生的m/z699、m/z655和m/z521的特征離子，提示在裂解過程中產生了頭孢拉定二聚體；而m/z891的特征離子提示結構中存在β-內酰胺環(圖3)。

綜上，該類頭孢菌素的主要聚合反應為側鏈氨基與β-內酰胺環的反應，實際產品中聚合物主要為二聚體，僅在非水溶液中強制聚合才易產生三聚、四聚體等多聚體。采用RP-HPLC方法，利用產品中的二聚體作為指針性聚合物可以表征產品中的聚合物總量，是理想的質控分析方法，但應用藥典收載的有關物質方法時通常應進行優化，保證聚合物雜質被洗脫出。質譜分析中該類頭孢菌素聚合物的聚合位點易斷裂，形成藥物單體或低聚物；聚合物的主要裂解途徑符合藥物單體的質譜裂解規律。通過高分辨質譜(HRMS)的精確分子量，得到聚合物的元素組成，可以進一步確證推測的聚合物結構的正確性。

2 7位側鏈不具有伯氨基結構的頭孢菌素

7位側鏈不具有伯氨基結構的頭孢菌素，實際產品中3位側鏈多具有易解離的基團，如頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢硫脒等。根據目前對β-內酰胺抗生素聚合反應的認知[4,12]，母核羧基作為活性基團與另一分子的β-內酰胺環或3位側鏈的反應是最可能的聚合反應途徑；與β-內酰胺環的反應通?？尚纬梢粚Σ钕虍悩嬻w，而與3位側鏈的反應通常形成單一的聚合物(圖4)；由于該類頭孢菌素的3位側鏈易被水解，因而與β-內酰胺環反應形成的二聚體可能存在三種3位側鏈水解物(按文獻[5]可分別命名為水解物I、水解物Ⅱ和水解物Ⅳ)，而與3位側鏈反應形成的二聚體僅能產生一種水解物。

比較該類頭孢菌素質譜裂解途徑(圖5)與圖2A的差異：雖然它們均可發生β-內酰胺環的A裂解反應，但A2碎片的豐度在不同化合物中的差異較大，R3為甲氧基取代時A2離子豐度最弱；當其失去3位側鏈后，不再發生經典的β-內酰胺環B裂解反應，且A裂反應主要產生A3碎片，A1離子豐度較弱， R3為甲氧基取代時沒有A1離子[13-14]。

文獻[8]報道了2個頭孢唑林二聚體(分子量均為794 Da，分別稱之為聚合物1和聚合物2)；根據頭孢菌素的聚合反應機理推測分子量為794 Da的頭孢唑林二聚體可能有5種結構(圖6A)。結構C由于不含β-內酰胺結構，在質譜分析中被首先排除。利用上述質譜裂解規律分析頭孢唑林聚合物1：其二級質譜圖中可見β-內酰胺環的A2特征裂解碎片(m/z628)，同時存在m/z455和m/z473的頭孢唑林碎片和頭孢唑林開環物特征碎片，故其可能為結構A或D(圖6B)；但根據質譜裂解途徑分析無法判斷其究竟是何種結構[8]。利用結構已知的頭孢唑林二聚體對照品(結構D)(廣州牌牌生物科技有限公司)進行驗證，對照品保留時間與二聚體1相同，即證明頭孢唑林二聚體1為結構D(未發表資料)。

文獻[8]未能推測出聚合物2的可能結構。由于聚合物2 的質譜圖中出現了經典的β-內酰胺環A3特征離子(m/z635)(圖6B)，故推測其可能結構為B或E(具有可解離的3位側鏈)。由于質譜圖中未出現特征的頭孢唑林碎片(m/z455)，但出現了m/z473的特征碎片(與頭孢唑林開環物特征碎片相同)，因此，對m/z473特征離子的解析成為關鍵。如果頭孢唑林二聚體在3位側鏈斷裂前發生經典的β-內酰胺環B裂解反應，則能形成m/z473的特征離子(圖6C)；據此，可推測出聚合物2的質譜裂解途徑(圖6D)。同樣，僅根據質譜裂解途徑分析無法判斷聚合物2究竟是結構B或E。由于文獻[8]中未發現聚合物2具有同分異構體(提示不存在差向異構體)，且通過對頭孢唑林、聚合物1和聚合物2的UV光譜比較，認為二聚體2母核的共軛結構發生了變化(二聚體2通過酯鍵對具有完整結構的頭孢唑林母核的共軛結構影響較大)，因此認為聚合物2更可能為結構E(最終應通過雜質對照品進行確認)。

文獻[9]采用HPSEC-柱切換-LC-MS技術分析注射用頭孢硫脒中的聚合物，發現實際樣品中存在分子量為884的二聚體(圖7D)，推測其可能為羧基與3位側鏈的聚合產物(圖7A)；雖然羧基與的β-內酰胺環的反應也可能形成分子量為884的二聚體(圖7B)，但質譜裂解途徑分析不支持該結構(無法解釋m/z473的頭孢硫脒特征離子碎片)(圖7C)，因而支持文獻推測的結構的正確性。

文獻[10]采用二維RPLC-QTOFMS技術在頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉樣品，發現4個頭孢哌酮二聚體雜質峰：雜質峰6與峰7的質譜信息相似(MS1均為m/z1175.2797，分子式為C48H50N14O16S3)，雜質峰8與峰9的質譜信息相似(MS1均為m/z1291.2926，分子式為C50H54N18O16S4)，提示互為差向異構體。但作者推測它們為側鏈仲氨基與β-內酰胺環的聚合產物(圖8A)。然而，該反應機理在以往的研究中從未被證實，根據目前對β-內酰胺抗生素聚合反應的認知[4,14]，母核的羧基與β-內酰胺環聚合可以產生一對二聚體差向異構體(MW1290，分子式為C50H54N18O16S4)(圖8B)，且對其質譜裂解途徑進行分析可以較好地解釋峰8/峰9質譜圖中的主要碎片離子，故認為峰8/峰9更可能為圖8B的結構。圖8B的二聚體脫去3位側鏈形成的內酯結構(MW1174，分子式為C48H50N14O16S3)與峰6/峰7的結構信息一致(圖8C)，對其質譜裂解途徑進行分析(圖8D)，也可較好地解釋其質譜圖中的主要碎片離子(圖8F)；雖然母核的羧基與3位側鏈的反應也可以形成分子量1174的二聚體(圖8D)，但該反應不能產生差向異構體；因此認為峰6/峰7更可能是圖8C的結構。

縱上，目前對該類頭孢菌素聚合物分析的研究較少，雖然認為它們可以通過頭孢菌素母核的羧基攻擊另一分子的β-內酰胺環或3位側鏈發生聚合，但何種反應為主要的聚合反應途徑目前缺乏理論計算的支持；在實際分析中，似不同結構的化合物聚合反應途徑不完全相同。對該類頭孢菌素實際產品中的聚合物進行分析，通常僅發現二聚體且含量均較低；在水溶液中進行強制聚合，通常不能增加聚合物的含量，而高濕條件下固態聚合是增加聚合物含量的有效途徑。在利用質譜裂解途徑推斷聚合物的結構時，通過分析β-內酰胺環的A裂解碎片，可以幫助判斷聚合反應位點：如具有完整頭孢菌素結構的聚合物，質譜分析中3位側鏈斷裂易產生A3碎片；而如果出現A2碎片，提示其可能是與3位側鏈的聚合產物；通過分析聚合物是否存在差向異構體亦可幫助判斷聚合反應位點。當質譜裂解途徑分析不能推斷出聚合物的最可能結構時，應通過聚合物對照品進行確認。

3 其他結構的頭孢菌素

頭孢西丁鈉、頭孢呋辛鈉等結構中存在氨甲酰結構的頭孢菌素，理論上它們應當與其他頭孢菌素具有相似的聚合反應途徑，但采用柱切換-LC/MS技術分析頭孢西丁鈉強制聚合溶液中的聚合物時，雖然發現其中存在多個聚合物雜質(圖9)，但均無法依據頭孢菌素的已知聚合反應途徑(母核羧基的反應或3位側鏈中氨甲酰結構中氨基的反應)推測出可能結構，且在實際產品中也未檢測到聚合物雜質[11]。對頭孢呋辛鈉水溶液降解雜質的分析顯示，其3位側鏈水解可形成去氨甲酰頭孢呋辛，去氨甲酰頭孢呋辛3位側鏈的羥基可以被氨基取代，進一步形成3位具有伯氨基結構的降解物[15]，在對頭孢西丁鈉雜質譜的分析中亦發現相似的降解物[16]。由于伯氨基在頭孢菌素的聚合反應中是最重要的聚合反應位點[4-5,12]，使得該類頭孢菌素的聚合反應變得更加復雜。文獻[11]強制聚合反應介質為水溶液，因而其觀測到聚合物雜質更可能與頭孢西丁降解物參與的聚合反應有關。對該類頭孢菌素聚合物解析需要進一步研究。

4 總結

7位側鏈含有伯氨基結構的頭孢菌素，側鏈氨基攻擊另一分子的β-內酰胺環是主要的聚合反應途徑；該類頭孢菌素在水溶液中強制聚合，通常僅能形成二聚體，在非水溶液中聚合可以形成多聚體；推測該類頭孢菌素的聚合物結構：首先根據反應機理推測可能的結構，再利用質譜裂解規律對所推測的結構進行驗證，必要時通過高分辨質譜對其結構進行再確證。

7位側鏈不含伯氨基結構的頭孢菌素主要通過母核羧基攻擊另一分子的β-內酰胺環或3位側鏈進行聚合，二者的區別在于前者可形成一對差向異構體；對該類頭孢菌素進行強制聚合時宜采用高濕環境固態聚合的方法，在水溶液中通常不易形成聚合物。不同品種究竟易通過何種聚合反應途徑進行聚合目前沒有較明確的結論；利用質譜裂解規律有時無法判斷聚合物的具體聚合位點，因而采用反合成方法獲得聚合物對照品是確證該類頭孢菌素聚合物結構的理想方法。由于該類頭孢菌素的3位側鏈易水解，由羧基與β-內酰胺環形成的聚合物理論上可形成3種側鏈水解物，羧基與3位側鏈環形成的聚合物僅能形成1種水解物，利用該特性通過對聚合物水解物的發現也可以幫助判斷二類聚合物。

對部分頭孢菌素如頭孢西丁鈉等，按目前已知的聚合反應機理尚不能完全解釋其聚合反應途徑，但該類頭孢菌素實際樣品中的聚合物含量均較低，提示相對于其他頭孢菌素，它們不易發生聚合反應。