7-氨噻肟頭孢菌素的聚合物分析

胡昌勤 李進 張夏

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

在藥物雜質譜(impurity profile)控制中，對β-內酰胺抗生素聚合物的控制是當前國內外關注的熱點之一[1]。β-內酰胺抗生素主要包括青霉素和頭孢菌素兩大類，作者已經對青霉素類抗生素聚合物分析的進展進行了綜述[2]。頭孢菌素作為臨床中最重要的一類抗菌藥物，是當前國內仿制藥一致性評價的熱點品種。7位側鏈具

有氨噻肟結構的頭孢菌素(7-氨噻肟頭孢菌素)，在增強對β-內酰胺酶的穩定性、改善抗菌譜等方面具有獨特的功能[3]，是第三代頭孢菌素的典型代表，且已逐漸發展為一大家族(圖1)，根據其3位側鏈的特點可分為2組，第1組：主要為口服頭孢菌素，其3位的R2基團不易解離；第2組：為注射用頭孢菌素，其3位的R2基團易被水解。已知7-氨噻肟結構中的自由氮基通過攻擊另一分子的β-內酰胺環可形成聚合物[4-5]；此外，根據對青霉素聚合反應機理的認知[2]，頭孢菌素還可以通過羧基攻擊另一分子的β-內酰胺環發生聚合反應；而各國藥典中給出的頭孢噻肟二聚物結構(圖2a)提示，氨噻肟結構中的氨基還可以與3位側鏈發生聚合反應。由于頭孢菌素的3位側鏈和6元環結構較青霉素母核更不穩定[6]，聚合物易發生多種降解反應，使得對頭孢菌素聚合物結構的分析較青霉素更加困難。伴隨著科學技術的進步，近年來人們對β-內酰胺抗生素聚合物的聚合反應機理、結構等的認知不斷完善，對7-氨噻肟頭孢菌素的聚合物分析也取得了較大的進展[7-12]，但在利用LC-MS進行結構解析中也遇到一些困惑。本文對近年來的工作進行回顧性總結，希望形成相對系統地對該類抗生素聚合物分析及利用LC-MS進行結構解析的策略與方法，進而指導對其他頭孢菌素聚合物的分析。

1 7-氨噻肟頭孢菌素聚合物

頭孢唑肟鈉與頭孢噻肟鈉是氨噻肟頭孢菌素的典型代表結構(圖1)，前者沒有3位側鏈，后者的3位側鏈易被水解。分別采用凝膠色譜-柱切換-質譜分析技術[2]分析二者強制聚合溶液中的聚合物雜質：在頭孢噻肟鈉的強制聚合溶液中，主要聚合物為氨基與3位側鏈反應(聚合反應I)形成的二聚體(圖2a)，沒有發現羧基與β-內酰胺環聚合形成的二聚體[10]；在頭孢唑肟中僅發現氨基與β-內酰胺環反應(聚合反應Ⅱ)形成的一對二聚體非對映異構體(圖2b)，也沒能發現羧基與β-內酰胺環的聚合反應產物(圖2c)[13-14]。上述結果提示，在7-氨噻肟頭孢菌素的聚合反應中，氨基是主要的聚合活性位點，羧基與β-內酰胺環的聚合反應不易發生。進一步分析頭孢噻肟鈉中的各類聚合物(圖3A)，在按聚合反應I形成的聚合物中，主要聚合產物為二聚體(簡稱二聚體I)，沒能發現聚合反應Ⅱ形成的二聚體(簡稱二聚體Ⅱ)，但發現多個二聚體Ⅱ側鏈水解形成的水解產物。由頭孢菌素的降解反應機理[15-16]可知，理論上二聚體Ⅱ的側鏈水解可形成4種不同的水解產物，將其分別命名為水解物I-Ⅳ(圖3B)；圖3A的結果提示，第2組頭孢菌素由于其3位具有易解離基團，形成的二聚體Ⅱ不穩定，在強制降解反應中易被進一步水解成不同的水解物。

2 7-氨噻肟頭孢菌素聚合物的特性

第2組氨噻肟頭孢菌素(圖1)中的聚合物主要為聚合反應I的產物。以二聚體I為例，它們具有相似的二級質譜圖(圖4A)，共性裂解途徑產生m/z791、m/z636和m/z396的碎片離子，其中b裂解是重要的特征裂解片途徑(圖4B)。由于二聚體I分子呈線性構型(圖5A)，該特性不僅使其易形成高聚合度的多聚體，如在頭孢噻肟鈉中已發現三聚體、四聚體[10]，且使得多聚體具有與二聚體相似的質譜裂解途徑(圖5B)，對二聚體I特征裂解途徑的認知，對三聚體、四聚體的解析具有重要的意義(圖5C)。

分析聚合反應Ⅱ產物的質譜裂解特性。以頭孢唑肟二聚體為例(圖6A)，其共性裂解途徑可產生m/z624、m/z481、m/z449和m/z383的特征離子，并易產生脫羥基、羧基等碎片離子，其中a裂解產生的頭孢唑肟[M+H]+峰是重要的特征裂解片途徑(圖6B)，是判斷二聚體Ⅱ水解物的重要依據；脫羧基反應(d裂解)與脫羥基反應同時存在，是判斷二聚體3位側鏈是否形成內酯結構的重要依據。

3 7-氨噻肟頭孢菌素聚合物的衍生物/降解物

3.1 3位側鏈水解物

第2組頭孢菌素的3位側鏈易發生水解反應，如何判斷聚合物中側鏈的水解位置是推測水解物結構的關鍵。質譜裂解途徑結合RP-HPLC保留值分析是較好的分析策略。

比較頭孢曲松二聚體Ⅱ不同側鏈水解物的空間構型(圖7A)，水解物Ⅲ和水解物Ⅳ的空間構型較對應的水解物Ⅰ和水解物Ⅱ更松散，使其保留值較水解物Ⅰ和水解物Ⅱ大；水解物Ⅱ和水解物Ⅳ分別較水解物Ⅰ和水解物Ⅲ的空間構型更緊湊，故水解物Ⅱ/水解物Ⅳ中至少一個異構體的保留值較水解物Ⅰ/水解物Ⅲ更小。即利用RP-HPLC的保留值可幫助判斷聚合物水解物的水解位點。頭孢噻肟聚合物的RPHPLC分析較好地驗證了上述規律(圖3A)。

以對頭孢噻肟二聚體水解物(MW850)的分析為例說明質譜解析二聚體水解物的過程。雖然二聚體Ⅱ側鏈水解形成的羥基體或內酯結構(圖3)的分子量均可為850 Da，但二級質譜圖(圖7B)中僅見脫羧基碎片，未見脫羥基碎片，提示其可能為內酯結構；結合頭孢噻肟鈉的質譜裂解規律[17]，質譜圖中m/z456的碎片峰及可由頭孢噻肟分子裂解產生的m/z396、m/z353、m/z324和m/z227特征離子，提示m/z456的碎片峰為頭孢噻肟的[M+H]+加合離子峰；再結合保留值推測其為頭孢噻肟二聚體Ⅱ水解物Ⅳ(圖7C)。

3.2 3位丙烯基異構化產物

第1組7-氨噻肟頭孢菌素中3位具有丙烯基結構的頭孢菌素(圖1)如頭孢丙烯、頭孢克肟，主要通過聚合反應Ⅱ應形成聚合物，R1結構的差異對聚合反應沒有明顯影響，但聚合過程中β-內酰胺環開環易形成γ-內酯并發生異構化，使得聚合物呈多種異構體。如頭孢地尼的3位的丙烯基結構在酸性及中性條件下異構化，理論上可形成8種異構體(具有3個手性位點)[18-19]，提示頭孢地尼二聚體(二聚體Ⅱ)也可能在聚合中形成多種具有相同分子量的二聚體γ-內酯。如在分析頭孢地尼聚合物時[12]，雜質Unk-7-10四個雜質峰的一級和二級質譜圖完全一致，它們的相對分子質量均為790 Da；結合頭孢地尼的質譜裂解規律[17]分析其可能的裂解途徑：二級質譜圖中僅發現m/z744的脫羧基碎片，m/z773的脫羥基碎片不明顯，且發現m/z158的特征碎片，提示3位側鏈為內酯結構；而特征的m/z396和m/z242離子碎片，提示形成了頭孢地尼[M+H]+加合離子峰，進而推測出二聚體γ-內酯的異構化位點(圖8)。

比較頭孢地尼、頭孢克肟二聚體和其γ-內酯在RP-HPLC中的保留值，二者γ-內酯的保留值均大于二聚體，該結果也可用于對聚合物結構的驗證。

3.3 7位側鏈衍生物

采用凝膠色譜-柱切換-質譜技術分析頭孢他啶中的聚合物[8]，發現兩個分子量為1159 Da的聚合物雜質(HPSEC-2a 和HPSEC-2c)，比頭孢他啶二聚體Ⅰ的分子量多146 Da，命名為頭孢他啶二聚體衍生物I；同時，發現2個為692 Da的雜質(HPSEC-4a和HPSEC-4b)，比頭孢他啶的分子量多146 Da；此外，還發現兩個分子量為1115 Da的聚合物雜質(HPSEC-3c和HPSEC-3f)，比頭孢他啶二聚體衍生物I的分子量少44 Da，命名為頭孢他啶二聚體衍生物Ⅱ；依據質譜分析結果，推測他們的取代位點均為7位側鏈。雖然文獻[8]對他們的可能結構進行了推斷，但無法合理解釋在強制聚合溶液中他們的形成機制。由于HPSEC-2a和HPSEC-2c的二級質譜圖基本相同，HPSEC-4a和HPSEC-4b的二級質譜圖基本相同，推測他們的產生途徑相似，因此，對分子量為692的雜質的結構解析，將有助于推測頭孢他啶二聚體衍生物Ⅰ的結構。

由頭孢菌素的降解反應機理可知，伴隨著β-內酰胺環的開環，可發生系列重排、降解反應[15-16]。依據該降解反應機理，頭孢他啶二聚體Ⅰ水解可以形成分子量為692的頭孢他啶降解物，該衍生物為順反異構體(圖9A)，這可以較好地解釋頭孢他啶二聚體衍生物I的來源，即由頭孢他啶7位側鏈的氨基與該降解物的3位側鏈聚合產生(圖9B)。而頭孢他啶二聚體衍生物Ⅱ則可能是分子量為692的頭孢他啶降解物進一步脫羧，形成分子量為648的降解物(圖9A)，該降解物與另一分子頭孢他啶按聚合反應Ⅱ途徑聚合，同時3位側鏈水解形成內酯，產生分子量為1115 Da的二聚體衍生物Ⅱ，對其質譜裂解途徑的分析(沒有發現頭孢他啶的分子離子峰，證明其為水解物Ⅲ)支持所推測結構的正確性(圖9C)。

3.4 氨基與羧基?；磻撍?/h3>

在對頭孢噻肟、頭孢克肟和頭孢他啶的聚合物分析中，分別發現分子量為832 Da(HPSEC-4)、分子量為888 Da(HPSEC-3h)和分子量為1541 Da(HPSEC-3g, 3h)的聚合物雜質，他們均被認為由氨基與羧基的?；磻a生，但HPSEC-4被認為是頭孢噻肟二聚體I的分子內脫水產物[10]，HPSEC-3h被認為是頭孢克肟分子間脫水形成的二聚體[11]，HPSEC-3g, 3h被認為是頭孢他啶分子間脫水形成的三聚體[8]。雖然對青霉素分子聚合反應的理論計算表明，藥物分子側鏈的氨基與另一分子2位羧基的反應較其他聚合反應途徑較難發生[20]，但上述結果提示，在強制聚合過程中7-氨噻肟頭孢菌素中的氨基與母核羧基的?；磻_已發生，但究竟更易發生分子內?；磻€是分子間?；磻胁荒芙o出明確的答案。

頭孢噻肟二聚體I整個分子呈線性構型(圖5A)，氨基與羧基在分子的兩端，不利于發生分子內的?；磻?；對頭孢克肟二聚體差向異構體的空間構型分析同樣得出其不利于發生分子內的?；磻慕Y論(圖10A)；故認為理論上7-氨噻肟頭孢菌素的氨基與羧基的分子間?；磻菀装l生。重新推測頭孢噻肟中HPSEC-4雜質(MW832)的可能結構，認為其更可能為頭孢噻肟分子間脫水形成的二聚體水解物，質譜裂解途徑分析支持新推測結構的合理性(圖10B)。同理，頭孢他啶三聚體的空間構型也不利于氨基與羧基發生分子內的?；磻?。重新推測HPSEC-3g,3h(分子量為1541 Da的頭孢他啶三聚體脫水物)的可能結構：由于二者的二級質譜圖相似，提示二者為同分異構體，可能為聚合反應Ⅱ的產物；未發現特征的m/z547碎片，提示質譜分析中未產生特征的頭孢他啶[M+1]+峰；結合已知的頭孢菌素質譜裂解規律，對其質譜圖中的碎片峰進行歸屬，認為其最可能結構是頭孢他啶二聚體Ⅱ的羧基與另一分子頭孢他啶的氨基發生的分子間?；a物的水解物(圖10C)。

3.5 二聚體脫氫物

采用LC-MS法分析頭孢克肟中的雜質unk-6和unk-7，二者的分子量均為904 Da，較頭孢克肟二聚體少2 Da，提示發生了脫氫反應；二者的二級質譜圖差異明顯(圖11A)，在RP-HPLC中的保留值相差也較大，提示二者的結構可能不完全不同。文獻[11]認為二者的結構相同，且所推測的結構無法從機理上解釋在強制聚合溶液(偏堿性水溶液)中他們的產生過程。由頭孢地尼的異構化機理[18-19]可知，β-內酰胺開環可導致3位側鏈的雙鍵轉移，使得氫化噻嗪環中的電子云分布發生變化，進而發生雙鍵的重排，形成脫氫反應(圖11B)。分子量為904 Da的頭孢克肟脫氫二聚體，可以先按氨基與β-內酰胺環聚合(聚合反應Ⅱ)途徑形成二聚體，再脫氫形成頭孢克肟脫氫二聚體Ⅰ(圖11C)，也可以先按羧基與β-內酰胺環聚合形成二聚體(不含氨基頭孢菌素的常見聚合反應途徑)，再脫氫形成頭孢克肟脫氫二聚體Ⅱ(圖11D)。從聚合反應機理的角度，脫氫二聚體Ⅰ較脫氫二聚體Ⅱ更易產生；LogP值的計算提示脫氫二聚體Ⅱ的極性更大，在RP-HPLC中的保留值應較??；強制聚合溶液分析顯示，Unk-7的保留值較Unk-6大，其產生量也較Unk-6大，因此推測Unk-7可能為脫氫二聚體I，Unk-6可能為脫氫二聚體Ⅱ。結合頭孢菌素的質譜裂解規律，分別對二者質譜圖中的碎片峰進行歸屬：Unk-7中m/z736和m/z768的特征裂解碎片，提示分子中存在完整的β-內酰胺環結構，裂解途徑分析支持Unk-7可能為脫氫二聚體I(圖11C)； Unk-6的質譜裂解途徑分析支持其可能為脫氫二聚體Ⅱ(圖11D)。

3.6 氫化噻嗪環降解物

按聚合反應Ⅱ等途徑形成的頭孢菌素聚合物分子中通常含有β-內酰胺環開環結構，開環分子中的氫化噻嗪環可進一步水解形成巰基，繼而再發生重排、水解等降解反應[15-16]。如頭孢克肟強制降解溶液中的雜質Unk-5(MW828)、HPSEC-3i(MW797)等。

對頭孢克肟雜質Unk-5進行解析。雖然分子量為828 Da的降解物可能由氨基與β-內酰胺環形成的二聚體降解產生，也可能由羧基與β-內酰胺環形成的二聚體降解產生，但其質譜圖中m/z811、m/z783、m/z739的特征碎片峰提示分子中存在完整的β-酰胺環，未發現m/z454的頭孢克肟[M+H]+峰，僅出現特征的m/z545碎片(β-內酰胺環裂解產生)；進而推測其可能為羧基與β-內酰胺環形成的頭孢克肟二聚體的降解產物，對其可能的質譜裂解途徑分析見圖12A。而對雜質HPSEC-3i(MW797)的解析，提示其是由氨基與β-內酰胺環形成的頭孢克肟二聚體降解產生(圖12B)。

4 總結

7-氨噻肟頭孢菌素的聚合反應主要與7位側鏈的氨基有關。對3位不含可解離基團的第1組頭孢菌素，聚合反應主要由氨基攻擊另一分子的β-內酰胺環發生，聚合物為一對差向異構體；對3位具有可解離基團的第2組頭孢菌素，聚合反應既可通過氨基攻擊另一分子的3位側鏈(聚合反應Ⅰ)發生，也可以通過氨基攻擊另一分子的β-內酰胺環(聚合反應Ⅱ)發生。

由頭孢菌素的結構特點可知，其聚合物結構具有不穩定性，進而導致了聚合物結構的多樣性。如第1組具有丙烯基結構的頭孢菌素，其易形成γ-內酯并發生差向異構化，理論上二聚體可以形成8種γ-內酯；第2組頭孢菌素，其3位側鏈易水解形成羥基體、內酯結構，理論上每一種由聚合反應Ⅱ形成的二聚體水解可形成8種異構體。此外，氨噻肟頭孢菌素聚合物中還發現一些偶見的特殊衍生物/降解物，包括：7位氨基衍生物，如頭孢他啶、頭孢甲肟中發現較二聚體I多146 Da的二聚體衍生物等；氫化噻嗪環水降解物，如分子量為828 Da的頭孢克肟二聚體降解物等；3位丙烯基結構脫氫物，如頭孢克肟脫氫二聚體等。而7-氨噻肟頭孢菌素中的偶見聚合反應途徑，如側鏈的氨基與另一分子母核羧基的?；磻?，母核的羧基攻擊另一分子β-酰胺環的聚合反應，更使得7-氨噻肟頭孢菌素的聚合物具有高度的復雜性。

針對頭孢菌素聚合物的結構特點，采用LC-MS技術推測聚合物的結構時，首先應根據具體頭孢菌素的結構確定其最可能的聚合反應途徑；其次根據LC-MS給出的分子量信息及對頭孢菌素降解反應的認知，推測出各種可能的結構；第三，基于對頭孢菌素及聚合物質譜裂解規律的認知，對聚合物二級質譜中的主要碎片峰進行歸屬，確認最可能的結構；最后利用RP-HPLC的保留值驗證所確認結構的正確性。

雖然頭孢菌素聚合物的結構具有多樣性，然而在對實際樣品的分析時發現通常存在明顯的指針性聚合物，如第1組頭孢菌素的二聚體，第2組頭孢菌素的二聚體I，他們的含量可基本表征產品中總聚合物的水平，使得利用更專屬的RP-HPLC方法控制產品中的聚合物含量成為可能。