利奈唑胺葡萄糖注射液的質量分析

裘亞 張含智 丁穎 呂丹丹 趙敬丹 張夢悅 劉浩

(上海市食品藥品檢驗研究院，上海 201203)

利奈唑胺(linezolid)是由美國Pharmacia & Upjohn公司(已被Pfizer公司收購)研制開發的首個惡唑烷酮類抗菌藥物(圖1)，主要用于治療革蘭陽性菌及多重耐藥菌引起的感染；2000年在美國上市[1]，2006年在中國獲批上市。目前國內上市的劑型包括利奈唑胺片、利奈唑胺干混懸劑和利奈唑胺葡萄糖注射液。國產利奈唑胺葡萄糖注射液于2015年獲批上市。2020年利奈唑胺葡萄糖注射液被列為國家評價性抽驗品種。

根據國家藥品監督管理局藥品數據信息，利奈唑胺葡萄糖注射液共有9家生產企業(8家國內生產企業和1家國外生產企業)，17個批準文號，2種規格，分別為100 mL(0.2 g利奈唑胺)和300 mL(0.6 g利奈唑胺)。本次抽驗共完成83批樣品的檢驗，規格包括100 mL(57批)和300 mL(26批)；涉及5家制劑生產企業，7個批準文號；從生產企業、經營企業和醫療機構抽取的樣品占比分別為13.3%、66.3%和20.5%。經調研，各制劑生產企業所用利奈唑胺原料藥合成工藝均存在差異；藥用輔料包括葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和注射用水，其中不同企業的產品處方中檸檬酸和檸檬酸鈉的用量稍有差異。

中國藥典2015年版、歐洲藥典10.0版、英國藥典2020年版、美國藥典43版及日本藥典17版均未收載利奈唑胺葡萄糖注射液；僅美國藥典43版收載利奈唑胺。利奈唑胺葡萄糖注射液的現行法定執行標準均為國家食品藥品監督管理局標準。本研究依據現行藥品質量標準的檢驗結果，結合探索性研究情況，對當前利奈唑胺葡萄糖注射液的質量狀況進行客觀評價與分析，并對現行法定質量標準提出改進建議。

1 儀器與試藥

Waters 2695e型高效液相色譜儀；Agilent 1260型高效液相色譜儀；Agilent 1100-6550型高效液相-四極桿-飛行時間質譜聯用儀；Agilent1200-AB Sciex 5000型Q-Trap液相質譜聯用儀；Agilent 8800型電感耦合等離子體質譜儀。

83批次利奈唑胺葡萄糖注射液均為2020年度國家藥品評價性抽驗樣品，涉及5 個生產企業(A、B、C、D和E企業)；利奈唑胺(USP，批號：R072F0，99.6%)；葡萄糖(EP，批號：1.0，91.0%)；3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺(阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：C1907130，98.0%)；BHA(批號：81202899，98%)、BHT(批號：MCCC0032，99.0%)、TBHQ(批號：S2E7J-OM，98.0%)、抗氧劑1010(批號：MKCK3424，98%)、抗氧劑330(批號：MKBW7797V，99.0%)、抗氧劑1076(批號：MKCK8428，99%)均來自于阿法埃莎化學有限公司；多元素標準溶液(國家有色金屬與電子材料分析測試中心，批號195044-2)；鈀標準溶液(國家有色金屬與電子材料分析測試中心，批號189029)；混合內標溶液(Agilent，批號1-152YJY2)；乙腈、甲醇、甲酸和三氟乙酸均為色譜純，正己烷、無水乙醇、異丙醇、二乙胺和三乙胺均為分析純，水為超純水。

2 實驗方法

2.1 法定檢驗方法

83批樣品的法定質量標準分別為國家藥品監督管理局進口藥品注冊標準JX20180010、國家局標準YBH01092015、YBH01882016、YBH03822018和YBH00132019。主要檢驗項目包括鑒別、對映異構體、有關物質、葡萄糖和含量測定等。

2.2 探索性研究方法

2.2.1 有關物質

色譜柱：Zorbax SB C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相A：0.1%三氟乙酸溶液；流動相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液；線性梯度洗脫(0～2 min，B為10%；2～20 min，B為10%→20%；20～35 min，B為20%→75%；35～45 min，B為75%；45～50 min，B為75%→10%；5 0 ～5 5 m i n，B 為1 0%)；流速：1.0 m L/m i n；柱溫：35℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL；樣品濃度：1.0 mg/mL。

質譜條件：采用電噴霧離子源，正離子模式采集，掃描范圍(m/z)：50～1200，毛細管電壓：3500 V，錐孔電壓：1000 V，去溶劑溫度：200℃，干燥氣流量：14 L/min，碰撞電壓分別為10、20和30 eV。

2.2.2 對映異構體檢查

色譜柱：KR CHI-DMB(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：正己烷-無水乙醇-三乙胺(600:400:2)；流速：0.8 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL；樣品濃度：0.4 mg/mL。

2.2.3 葡萄糖含量測定

色譜柱：YMC-Pack PolyamineⅡ(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：乙腈-水(75:25)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；示差折光檢測器；進樣量：100μL；樣品濃度：2.5 mg/mL。

2.2.4 潛在基因毒性雜質的檢測

色譜柱：Agilent poroshell EC-C18(2.7 μm，4.6 mm×50 mm)；流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：乙腈，線性梯度洗脫(0～5min，B為10%→30%；5～5.1 min，B為30%→90%；5.1～8 min，B為90%；8～8.1 min，B為90%→10%；8.1～12 min， B為10%)；流速：0.5 mL/min；進樣量：2 μL。

質譜參數：采用電噴霧離子源，正離子模式采集；離子源溫度：500℃；電噴霧電壓：5500 V；CUR：20 L/min；CAD：Medium L/min；GS1：35 L/min；GS2：35 L/min；定量離子對：197.2-131.1；定性離子對：197.2-111.1。

對照品溶液的配制：稱取適量的3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺對照品用10%乙腈溶液溶解稀釋并制成2500 ng/mL的溶液，作為線性儲備溶液，精密量取適量，用10%乙腈溶液稀釋分別制成1、5、25、50、100和250 ng/mL的溶液，作為S1～S6線性對照品溶液。

供試品溶液的配制：精密量取利奈唑胺葡萄糖注射液1 mL，加10%乙腈溶液1.0 mL，混勻。

2.2.5 包材相容性研究

抗氧劑：色譜柱：YMC ODS-AM(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動相A：水；流動相B：乙腈；線性梯度洗脫(0～7 min，B為35%；7～14 min，B為35%→98%；14～42 min，B為98%；42～43 min，B為98%→35%；45～50 min，B為35%)；流速：1.9 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：276 nm；對照品溶液進樣量：10 μL；供試品溶液進樣量：100 μL。

金屬元素：氦碰撞單四級桿模式；功率1550 W；采樣深度10.0 mm；載氣流量0.50 L/min；霧化器泵速0.10 r/s；S/C溫度2℃；重復讀數次數3次；分析模式全定量。

3 實驗結果與討論

3.1 法定檢驗結果

按法定質量標準檢驗，83批利奈唑胺葡萄糖注射液的合格率為100%；但因各法定標準主要檢驗項目的方法及控制限度均存在差異，故難以根據法定標準檢驗結果對不同企業的產品質量進行比較。

3.2 探索性研究結果

3.2.1 有關物質

本次國抽樣品涉及的法定標準中JX20180010、YBH01092015、YBH01882016和YBH03822018標準采用了以0.1%三氟乙酸溶液-0.1%三氟乙酸乙腈溶液為流動相體系的梯度洗脫HPLC 系統，YBH00132019標準采用了以0.1%三乙胺溶液-甲醇為流動相體系的梯度洗脫HPLC系統；且各標準中所控制的特定雜質的名稱、數量和限度均各不相同(各標準共計含15個特定雜質)。美國藥典43版中利奈唑胺有關物質檢查采用以磷酸二氫鉀溶液-甲醇-乙腈為流動相體系的梯度洗脫HPLC 系統，并對3個特定雜質的限度進行了規定。在本部分探索性研究中，在對上述有關物質系統進行比較分析的基礎上，優化建立了能對利奈唑胺葡萄糖注射液中15個已知雜質進行有效分離的HPLC系統[2]，見“2.2.1”，系統適用性圖譜和各雜質結構分別如圖2和表1所示。采用新建的有關物質方法對83批抽驗樣品進行分析，各企業樣品測定結果如表2所示。

表1 各雜質分子式、化學結構和來源Tab.1 Proposed molecular formulas, structures and sources of impurities 1～15

表2 各企業產品有關物質測定結果Tab.2 The related substance results of the samples from different manufacturers

由測定結果可以看到，不同企業產品中各雜質水平基本相當，雜質總量均在1.0%左右，且除部分樣品中有少量工藝雜質(雜質5)檢出外，檢出的其余6個已知雜質均為降解雜質；提示雖然目前各制劑企業所用利奈唑胺原料藥的合成工藝存在著差異，但經純化工藝后均能有效地將工藝雜質去除。C企業和D企業產品中有1個含量大于0.10%且保留時間相同的未知雜質檢出，采用LC-Q-TOF對該雜質結構進行了初步分析[2]。

3.2.2 對映異構體

利奈唑胺分子結構中含1個手性中心，其存在一個對映異構體[3]。5個法定質量標準均采用手性固定相的HPLC法控制樣品中的對映異構體雜質，但方法和限度均存在差異。其中，YBH01092015標準采用CHIRALPAK AD-H色譜柱進行測定，YBH03822018標準采用CHIRALPAK AY-H色譜柱進行測定，這兩種色譜柱均不宜分析含水供試品；試驗結果也證實，多次進樣分析后，出現了柱效顯著下降的現象。因此，我們選擇YBH01882016、YBH00132019和JX20180010標準所采用的Kromasil DMB色譜柱，建立了統一的HPLC測定方法，見“2.2.2”，規定利奈唑胺峰與對映異構體峰的分離度應不小于2.0。

按新建立的方法對83批抽驗樣品進行分析，A和D企業樣品中均未檢出對映異構體雜質，B、C和E企業樣品中對映異構體雜質的含量均小于0.04%，說明目前各企業制劑所使用的利奈唑胺原料藥的生產工藝均能有效控制對映異構體雜質的含量。

3.2.3 葡萄糖含量測定

YBH00132019標準采用旋光度測定法測定樣品中的葡萄糖含量，專屬性較差；YBH01882016和YBH03822018標準采用容量滴定法(間接碘量法)，對實驗環境及實驗人員要求較高，且實驗操作較為繁瑣；YBH01092015和JX20180010標準采用高效液相色譜-示差折光檢測法。我們參照YBH01092015和JX20180010標準，建立了統一的HPLC方法，見“2.2.3”。

按擬定的方法對83批抽驗樣品進行測定，葡萄糖含量均在98.3%～103.5%之間(以標示量計)，平均值為101.0%；各企業產品的葡萄糖含量測定結果比較圖見圖3，A企業產品的葡萄糖含量相對較低。

3.2.4 潛在基因毒性雜質的檢測

函調中反饋的資料顯示：3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺為B企業利奈唑胺原料藥合成工藝中的中間產物；而C企業和D企業利奈唑胺原料藥生產工藝的起始原料均包括了N-芐氧羰基-3-氟-4-嗎啉基苯胺，如在后續反應中不能除盡該化合物，則其可能降解生成3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺。3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺為芳香胺類化合物，屬潛在基因毒性雜質；B企業和E企業原料藥內控標準中均對其進行了控制(限度分別為0.6和16 ppm)；但在注射液中均未對其進行控制。采用LC-MS方法(見“2.2.4”)對各企業代表性樣品中的3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺進行了檢測；結果如表3所示，各企業產品中均有潛在基因毒性雜質3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺檢出。另外，各企業樣品在加速穩定性試驗(溫度40℃，相對濕度75%)條件下放置3個月后，3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺的含量均略有增加，提示利奈唑胺在溶液狀態中可能降解生成微量的3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺。各制劑生產企業應關注利奈唑胺葡萄糖注射液中的3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺的含量變化，必要時在利奈唑胺葡萄糖注射液質量標準中增訂3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺檢查項，以進一步保證臨床用藥的安全性。

3.2.5 包材相容性研究

藥品與藥品包裝材料之間的相容性研究已成為目前藥品質量研究中的重要組成部分[4]。本次國抽樣品有玻璃瓶裝和多層共擠輸液袋裝兩種包裝形式，見表3。多層共擠輸液袋又稱軟袋，是繼玻璃輸液瓶、塑料輸液瓶之后出現的更為優良的輸液產品包裝，具有不含黏合劑、增塑劑，熱封性好、可高溫滅菌、無需排氣針、交叉污染風險小和運輸方便等優點[5-6]；但為了在存儲和使用過程中更加穩定，多層共擠輸液袋在加工過程中通常需加入抗氧劑、潤滑劑和抑酸劑等助劑，其中常用的抗氧劑主要為酚類抗氧劑，如抗氧劑1010、1076和330等[7]。建立了能同時檢測6種常見酚類抗氧劑(BHT、 BHA、TBHQ、330、1010和1076)的HPLC方法(見“2.2.5”)，其檢測限分別為0.2、0.2、0.5、1、1和1 μg/mL；對各企業的代表性樣品進行檢測，均未檢出上述抗氧劑。

表3 3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺測定結果Tab.3 The measurement results of 3-fluoro-4-morpholin-4-yl-phenylamine

多層共擠輸液袋裝加工過程中潤滑劑和抑酸劑等助劑的添加，可能會引入少量的有害金屬元素，其在與藥液長時間接觸后可能會遷移至注射液中[8]。另外，玻璃瓶包裝的注射液中也可能發生有害金屬元素從玻璃瓶遷移至藥液的情況[9]。因此，在本部分探索性研究中，我們還采用ICP-MS對各企業代表性樣品中的鉻、銅、鋅、鈀、鎘、錫、鋇和鉛等元素殘留進行了檢測。測定結果顯示，按每日攝入最大用量計算，各元素含量均遠小于其PDE值。

4 結論

本次評價性抽驗采用法定檢驗結合探索性研究對利奈唑胺葡萄糖注射液的質量和質量標準進行了分析和評價。通過探索性研究，利用建立的能同時對15個已知雜質進行有效分離的高效液相色譜方法，結合LC-Q-TOF技術對樣品中含量大于0.10%的未知雜質的初步結構分析，發現各企業樣品的雜質譜基本一致；提示雖然目前各制劑企業所用利奈唑胺原料藥的合成工藝存在著差異，但經純化工藝后均能有效地將工藝雜質去除。采用LC-MS對樣品中的潛在基因毒性雜質3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺進行了檢測，發現各企業產品中均有該雜質檢出，且在加速穩定性試驗中，3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺的含量略有增加，提示各制劑生產企業應予以關注，必要時應在利奈唑胺葡萄糖注射液質量標準中增訂3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺檢查項。

按照現行法定標準檢驗，本次抽驗樣品均符合標準要求。但現行標準均為局頒標準，各標準在檢驗項目設置、檢驗方法和限度等方面的規定不盡相同，因此較難通過法定檢驗結果對不同生產企業之間的產品質量進行比較。提示利奈唑胺葡萄糖注射液的質量標準亟待統一與提高。