超聲輔助低共熔溶劑提取玫瑰多酚及其抗氧化活性

王曉藝，李培坤，李錦紅，杜英杰，邊紅杰，賈士儒，崔建東*

（1.天津科技大學食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018）

玫瑰是薔薇科植物，又稱刺玫瑰、穿心玫瑰、筆頭花等[1]，具有良好的食用價值。而重瓣玫瑰是一種被廣泛食用的玫瑰，花瓣香甜、香氣馥郁，有疏肝理氣、活血散瘀、美容養顏等多種功效，含有多種活性物質，如多酚、多糖、有機酸等[2]。因此，玫瑰花中活性物質具有廣闊的應用前景。多酚是一種生物活性物質，其結構較為復雜，按結構可以分成酚酸類、類黃酮類和1，2-二苯乙烯及木酚素類[3-4]，由于多酚結構的特殊性，使其具有很好的抗氧化、抗衰老、抑菌等作用[5-7]。因此，將玫瑰花中的多酚提取出來進行綜合利用受到學者廣泛關注。目前，有機溶劑提取法和水浴加熱浸提法是提取多酚的常用方法[8]。但是傳統方法需要使用大量有機溶劑且提取時間長、操作復雜，不符合綠色化學的概念，在環保性和安全性上存在缺陷。因此，尋找一種綠色、環保且高效的植物多酚提取方法是十分必要的。

2003 年，低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）的概念首次被提出[9]，DES是一種新型的綠色溶劑，是由氫鍵供體和氫鍵受體組成的兩組分或三組分低共熔混合物，其熔點比各個組分更低[10]，具有良好的特性，如無毒、易于合成、成本低、生物可降解性等，已被公認為是傳統溶劑替代品[11]。Bajkac等[12]利用DES從大豆中提取異黃酮等活性物質。Ozturk等[13]利用DES從橙皮廢料中提取多酚類抗氧化劑。因此，DES在活性物質的提取方面具有較好的應用前景[14]。超聲輔助提取可以在較好地保持提取物的結構和活性的同時，使植物細胞內可溶性物質快速釋放、擴散并進入到提取劑中，具有省時、高效等特點[15-16]。因此，利用超聲輔助DES法提取植物中的活性物質可能會增強提取效果。

本文以盛產于河北省衡水市的重瓣玫瑰“豐花1號”為原料，采用超聲輔助DES法提取其中的多酚，運用單因素試驗優化提取工藝，并與傳統乙醇提取方法進行比較，利用NKA-9大孔吸附樹脂分離純化多酚，并研究純化后多酚的抗氧化活性。本文將為玫瑰多酚的綠色提取提供新思路，為其在天然抗氧化劑領域中的應用中提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花（重瓣玫瑰“豐花1號”）：產自河北衡水，60℃烘箱干燥6 h后粉碎過80目篩備用。

氯化膽堿：上海晶純生化科技股份有限公司；乳酸：上海源葉生物科技有限公司；維生素C、福林酚、沒食子酸標準品（純度99.9%）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2，2'-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]、無水碳酸鈉：上海麥克林生化科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

分析天平（ME204）：梅特勒-托利多儀器有限公司；集熱式磁力加熱攪拌器（DF-Ⅱ）：江蘇金怡儀器科技有限公司；紫外可見分光光度計（UV-5100）：上海元析儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機（Scientz-ⅡD）：寧波新芝生物科技股份有限公司；真空冷凍干燥機（FD-1）：上海田楓實業有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玫瑰多酚提取工藝流程

玫瑰花粉末→加入提取劑→混勻→超聲輔助提取→離心→取上清液。

1.3.2 多酚含量的測定

利用福林酚比色法[17]測定多酚含量：取不同質量濃度沒食子酸標準溶液（10、20、30、40、50 μg/mL）、水和樣品溶液1.0 mL，分別加入體積分數為10%的福林酚試劑 5.0 mL，靜置 3 min～8 min，再加入 7.5 g/100 mL碳酸鈉溶液4.0 mL，避光條件下反應1 h，以水為參比，于765 nm測定吸光值。分別以沒食子酸標準溶液質量濃度（x）、吸光值（y）為橫、縱坐標，線性回歸方程為y=0.0179x+0.114（R2=0.9995），多酚提取量計算公式如下。

式中：C為提取液中多酚的含量，mg/mL；V為提取液的體積，mL；M為玫瑰花粉末質量，g；N為稀釋倍數。

1.3.3 DES的篩選

1.3.3.1 DES的制備

DES的組成見表1。按照表1所示組分和摩爾比制備5種DES，將氫鍵受體與氫鍵供體按照一定摩爾比混合，置于磁力加熱攪拌器中，85℃恒溫攪拌至呈均一、澄清、透明的液體[18]。

表1 DES的組成Table 1 Composition of the DES

1.3.3.2 DES的篩選

稱取 0.1 g 玫瑰花粉末，按料液比 1∶30（g/mL），分別加入30%含水量的DES，在超聲時間10 min、超聲功率300 W、超聲溫度30℃條件下提取玫瑰多酚。

1.3.4 兩種方法提取玫瑰多酚的條件優化

分別用DES和乙醇作為提取劑提取玫瑰多酚，以多酚提取量為評價指標進行單因素試驗，考察DES含水量（10%、20%、30%、40%、50%）、乙醇體積分數（10%、20%、30%、40%、50%）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]、超聲時間（5、10、15、20、25 min）、超聲功率（300、400、500、600、700 W）、超聲溫度（30、40、50、60、70℃）、提取次數（1、2、3、4次）對玫瑰多酚提取量的影響。

1.3.5 玫瑰多酚凍干粉制備流程

玫瑰多酚提取液→NKA-9大孔樹脂吸附→70%質量分數的乙醇解吸附→旋轉蒸發→冷凍干燥→多酚凍干粉。

1.3.6 玫瑰多酚凍干粉抗氧化活性的測定

1.3.6.1 總還原能力測定

參考Shon等[19]的方法并略作改動，稱取適量的玫瑰多酚凍干粉，用蒸餾水配制成 10、20、30、40、50 μg/mL的玫瑰多酚樣品溶液。分別將上述濃度梯度溶液1.0 mL與1%鐵氰化鉀溶液1.0 mL混合，50℃下反應20 min后，加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL，渦旋均勻后，3 000 r/min離心10 min，將1 mL上清液、1 mL蒸餾水和0.2 mL的0.1%三氯化鐵溶液混勻，在700 nm處測定吸光值。以維生素C作為陽性對照。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力測定

參考Merghem等[20]的方法并略作改動，稱取適量玫瑰多酚凍干粉，用蒸餾水配制成 10、20、30、40、50 μg/mL的玫瑰多酚樣品溶液，分別將上述濃度梯度溶液1.0 mL與0.05 mg/mL的DPPH溶液1.0 mL混合，避光反應20 min，分別測定無水乙醇代替樣品、樣品溶液、無水乙醇代替DPPH溶液在517 nm下的吸光度，記為A0、A1、A2，并以維生素C作為陽性對照，計算DPPH自由基的清除率，公式如下所示。

式中：A1為加入樣品后的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH溶液的吸光度；A0為無水乙醇代替樣品的吸光度。

1.3.6.3 ABTS+自由基清除能力測定

參考Binsan等[21]的方法并稍作修改，ABTS工作液的制備：將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，在室溫下避光過夜（12 h～16 h），制成ABTS+自由基儲備液備用。將儲備液用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處的吸光值為0.7±0.02，以此作為ABTS工作液。稱取適量的玫瑰多酚凍干粉，用蒸餾水配制成 10、20、30、40、50 μg/mL 的玫瑰多酚樣品溶液，分別將上述濃度梯度溶液0.1 mL與ABTS工作液1.0 mL混合，避光反應6 min，分別測定無水乙醇代替樣品、樣品溶液在734 nm下的吸光值，記為A0、A1，并以維生素C作為陽性對照，計算ABTS+自由基的清除率，公式如下所示。

式中：A1為加入樣品的吸光度；A0為無水乙醇代替樣品的吸光度。

1.4 數據處理與分析

使用Excel軟件對試驗數據進行統計分析，使用Origin軟件對試驗數據進行作圖分析，每組試驗樣品測定3次。

2 結果與分析

2.1 DES的篩選

DES是由氫鍵受體和氫鍵供體組合而成的低共熔混合物，由于組成成分的不同，其對目標提取物的提取效率不同。不同DES對玫瑰多酚提取量的影響見圖1。

圖1 不同DES對玫瑰多酚提取量的影響Fig.1 Effect of different DES on the extraction yield of rose polyphenols

由圖1可以看出，5種DES對玫瑰多酚的提取量大小順序依次為DES-1[（94.87±0.51 mg/g）]＞DES-2[（93.90±0.62 mg/g）]＞DES-5[（88.77±0.57 mg/g）]＞DES-3[（87.31±0.9 mg/g）]＞DES-4[（86.16±0.55 mg/g）]，其中DES-1對多酚的提取量最大。從統計學上分析，DES-1與DES-2無顯著差異（P＞0.05），DES-1與 DES-3具有極顯著差異（P＜0.001），DES-1與DES-4和DES-5具有顯著差異（P＜0.01）。但是DES-2的黏度很大，不利于試驗操作；DES-1的提取效果高于其他DES，可能是因為相比于其他DES，DES-1的黏度小，分散性好，能更好地與多酚分子接觸，且極性與多酚最相近。因此，在后續試驗中選擇DES-1與乙醇進行對比試驗。

2.2 兩種方法提取玫瑰多酚的條件優化

2.2.1 DES的含水量和乙醇體積分數對玫瑰多酚提取量的影響

DES含水量對玫瑰多酚提取量的影響見圖2，乙醇體積分數對玫瑰多酚提取量的影響見圖3。

圖2 DES含水量對玫瑰多酚提取量的影響Fig.2 Effect of water content in DES on the extraction yield of rose polyphenols

圖3 乙醇體積分數對玫瑰多酚提取量的影響Fig.3 Effect of volume fraction of ethanol on the extraction yield of rose polyphenols

由圖2可知，隨著含水量的增加，多酚提取量先增加后減少?？赡苁怯捎谠贒ES中加入適量水，可以增加DES分子流動性，降低黏度，增加擴散能力[10]，使其能夠與多酚類化合物充分接觸，提高多酚提取效率，而當DES含水量較高時，過量的水使溶液極性過大，DES與多酚間氫鍵作用力減弱，從而使玫瑰多酚提取量下降[22]。當DES含水量為30%時，多酚提取量達到了最大值，為（94.86±0.25）mg/g。由圖 3可知，當乙醇體積分數在一定范圍內，隨著乙醇濃度的增加，玫瑰多酚的提取量呈現先增大后減小的趨勢，可能是由于在一定范圍內，乙醇體積分數的增高有利于多酚類物質的溶出，多酚提取量增加。當超過該范圍后，由于溶出的較多雜質多酚與競爭提取劑，導致多酚提取量降低。當乙醇體積分數為30%時，多酚提取量達到最大值，為（73.59±0.65）mg/g。因此選擇體積分數為30%的乙醇與含水量30%的DES-1進行后續的比較試驗。

2.2.2 料液比對玫瑰多酚提取量的影響

圖4 料液比對玫瑰多酚提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of rose polyphenols

由圖4可知，當料液比在一定范圍內，多酚提取量隨溶劑量的上升而增大，可能是由于溶劑增多后，能更好地與原料相互作用，傳質推動力提高，有利于增加多酚提取量[13]。當原料中的多酚類物質被全部提取出來后，繼續增加溶劑量，反而會使提取出來的多酚重新溶解到原料液中，使得多酚提取量下降，并且造成溶劑的浪費。當DES-1為提取劑，料液比 1∶40（g/mL）時，多酚提取量達到最大值，為（113.74±0.55）mg/g；當乙醇為提取劑，料液比1∶30（g/mL）時，多酚提取量達到最大值，為（73.81±0.59）mg/g。因此，分別選擇DES提取劑料液比 1∶40（g/mL）和乙醇提取劑料液比 1∶30（g/mL）進行后續試驗。

2.2.3 超聲時間對玫瑰多酚提取量的影響

超聲時間對玫瑰多酚提取量的影響見圖5。

圖5 超聲時間對玫瑰多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of rose polyphenols

由圖5可知，隨著超聲時間延長，玫瑰多酚提取量呈先增大后減小的趨勢?？赡苁且驗殡S著超聲時間增加，多酚逐漸溶出，使多酚提取量增加，但超聲時間繼續延長，可能會受光、熱等因素影響，導致部分提取出的玫瑰多酚被氧化，從而導致提取量的降低，并且超聲時間過長會增加能耗，增加提取成本[16]。當分別以DES-1和乙醇為提取劑時，超聲時間都在10 min時，玫瑰多酚提取量達到最大，分別為（115.75±0.55）mg/g和（74.75±0.48）mg/g。

2.2.4 超聲功率對玫瑰多酚提取量的影響

超聲功率對玫瑰多酚提取量的影響見圖6。

圖6 超聲功率對玫瑰多酚提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of rose polyphenols

從圖6可知，隨著超聲功率的增大，玫瑰多酚提取量呈先增大后減小的趨勢。在超聲過程中，可能由于超聲波可以提供能量，將強烈的振動傳遞給玫瑰花粉末和溶劑，原料細胞部分被破壞，加快胞內物質的釋放，并且強化了溶質擴散，因而提取量增加[23]。而當超聲功率繼續增大時，可能引起部分多酚的降解，從而使多酚提取量下降。當分別以DES-1和乙醇為提取劑，超聲功率都在400 W時，玫瑰多酚提取量達到最大，分別為（117.54±0.54）mg/g和（76.37±0.45）mg/g。

2.2.5 超聲溫度對玫瑰多酚提取量的影響

腦癱是一種致殘性慢性病，除了醫療康復外，需要長期、有效的家庭康復保駕護航，才能保證兒童康復的療效，讓更多兒童回歸家庭和社會。把醫院的醫療康復延續到家里，這更符合目前我國的基本國情。已有大量研究表明家庭康復在腦癱患兒的康復訓練中有顯著重要性，醫院加家庭康復訓練的強化訓練模式是兒童腦癱康復行之有效的方法[11-13],堅持家庭康復的腦癱患兒療效比不堅持家庭康復的更好。父母的心理狀況不良，將會影響家庭康復的執行，進而影響腦癱兒童康復療效。對腦癱患兒父母進行心理干預可以更好地提高患兒康復療效[14]。關注腦癱患兒父母的心理狀況及影響因素，出臺救助政策、完善社會服務支持、積極開展家長工作等有深遠意義。

超聲溫度對玫瑰多酚提取量的影響見圖7。

圖7 超聲溫度對玫瑰多酚提取量的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of rose polyphenols

由圖7可知，隨著超聲溫度的升高，玫瑰多酚提取量呈現先增大后減小的趨勢。隨著溫度的升高，分子運動加劇，提高了多酚類化合物在溶劑中的擴散系數和溶解度[24]，使得多酚提取量增加。而當超聲溫度繼續升高時，可能導致部分熱敏性的多酚被降解，使得多酚提取量減少。當分別以DES-1和乙醇為提取劑，超聲溫度都在50℃時，玫瑰多酚提取量達到最大，分別為（120.89±0.48）mg/g 和（78.94±0.52）mg/g。

2.2.6 提取次數對玫瑰多酚提取量的影響

提取次數對玫瑰多酚提取量的影響見圖8。

圖8 提取次數對玫瑰多酚提取量的影響Fig.8 Effect of extraction times on the extraction yield of rose polyphenols

由圖8可知，隨著提取次數的增加，玫瑰多酚的提取總量逐漸上升，以DES-1為提取劑和以乙醇為提取劑的趨勢相同，而當繼續增加提取次數時，提取次數對玫瑰多酚提取量的提高不明顯。因此，選擇提取次數為2次，在提取量合理的情況下，降低了提取成本。

2.3 兩種玫瑰多酚提取方法的比較

在DES-1與乙醇對多酚提取最優的條件下，將兩種方法所得的玫瑰多酚提取量進行比較，結果見表2。

表2 兩種玫瑰多酚提取方法的比較Table 2 Comparison of two extraction methods of rose polyphenols

與乙醇提取法相比，DES法的玫瑰多酚提取量提高了24%，這可能是由于DES與多酚類化合物之間有較強的氫鍵作用力，其擴散力、溶解度和極性有利于多酚類化合物的溶出[25]。因此，對于玫瑰多酚的提取，DES法較傳統乙醇提取法效果更好。在后續的抗氧化試驗中，使用DES法提取的玫瑰多酚進行測定。

2.4 玫瑰多酚抗氧化活性的測定

2.4.1 總還原能力

還原能力可延緩或終止自由基反應，可以通過還原能力的測定來評價樣品的抗氧化活性?？傔€原能力測定結果見圖9。

圖9 玫瑰多酚的總還原能力Fig.9 Total reducing power of rose polyphenols

由圖9可見，隨著樣品質量濃度增大，玫瑰多酚和維生素C吸光度逐漸增大，還原能力增強，試驗結果顯示，當玫瑰多酚和維生素C在10 μg/mL～50 μg/mL時，還原能力均隨著濃度的增加呈線性增加，而在10 μg/mL～20 μg/mL，玫瑰多酚和維生素 C 的還原能力相差較小。

2.4.2 玫瑰多酚DPPH自由基清除能力

玫瑰多酚DPPH自由基的清除能力見圖10。

圖10 玫瑰多酚DPPH自由基的清除能力Fig.10 The DPPH free radicals scavenging ability of rose polyphenols

由圖 10 可見，在 10 μg/mL～30 μg/mL，隨著多酚質量濃度的增加，其對DPPH自由基清除能力逐漸上升，當多酚質量濃度在30 μg/mL時，其對DPPH自由基的清除率已達到95.24%，隨后繼續增加多酚濃度對DPPH自由基清除效果沒有太大的影響，試驗結果顯示，高質量濃度的玫瑰多酚擁有較強的DPPH自由基清除能力。從20 μg/mL～50 μg/mL來看，玫瑰多酚與維生素C的DPPH自由基清除能力相當。

2.4.3 ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除能力見圖11。

圖11 玫瑰多酚ABTS+自由基清除能力Fig.11 ABTS+free radical scavenging ability of rose polyphenol

由圖11可見，隨著樣品質量濃度增大，玫瑰多酚和維生素C的ABTS+自由基清除能力逐漸增強。當玫瑰多酚與維生素C的ABTS+自由基清除率均接近100%時，玫瑰多酚濃度為40 μg/mL，而維生素C的濃度為50 μg/mL。因此，由試驗結果所示，玫瑰多酚清除ABTS+自由基能力優于維生素C。

3 結論

本研究以盛產于河北省衡水市的重瓣玫瑰“豐花1號”為原料，采用超聲輔助DES法對玫瑰花中的多酚進行高效快速提取，并與傳統乙醇提取方法進行比較。通過優化單因素試驗得到的DES法提取玫瑰多酚的最佳工藝條件：含水量30%的氯化膽堿-乳酸（摩爾比 1∶2）為最佳提取劑，料液比 1∶40（g/mL）、超聲時間10 min、超聲功率400 W、超聲溫度50℃、提取2次，所得多酚提取量為（136.20±1.23）mg/g。與乙醇提取法相比，DES法的多酚提取量提高了24%。表明超聲輔助DES法是一種高效環保的玫瑰多酚提取方法。對純化后的多酚進行體外抗氧化活性的測定，表明其具有良好的還原能力、DPPH自由基清除能力以及ABTS+自由基清除能力，具有較強的體外抗氧化活性。本研究為玫瑰多酚等活性物質的綠色提取提供了新思路，為其在天然抗氧化劑中的應用中提供了科學依據。