基于SIRT1-ERK1/2通路研究白藜蘆醇對環孢菌素A誘導高血壓的作用及機制

王 川，王鈺瑩，王 婷，史永恒，劉繼平，王 斌，衛 昊，劉 航

基于SIRT1-ERK1/2通路研究白藜蘆醇對環孢菌素A誘導高血壓的作用及機制

王 川1, 2，王鈺瑩1，王 婷1，史永恒1, 2，劉繼平1, 2，王 斌1, 2，衛 昊1, 2，劉 航3*

1.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046 2.陜西省中醫藥管理局中藥藥效機制與物質基礎重點研究室，陜西 咸陽 712046 3.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712000

研究白藜蘆醇對環孢菌素A（cyclosporine A，CsA）誘導高血壓的作用及其機制。采用離體血管培養技術和微血管張力描記技術研究CsA對5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）介導的平滑肌收縮量效曲線變化。大鼠sc CsA誘導血壓升高，給予白藜蘆醇進行干預，研究白藜蘆醇對血壓的影響；采用微血管張力描記觀察5-HT引起的動脈收縮量效曲線的變化；采用Western blotting檢測5-HT1B受體、沉默信息調節因子1（sirtuin 1，SIRT1）、細胞外信號調節激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2）蛋白表達。離體血管培養結果表明，白藜蘆醇通過激活SIRT1-ERK1/2通路抑制CsA誘導的收縮。動物實驗表明白藜蘆醇可以顯著降低CsA引起的血壓升高（＜0.05、0.01）；抑制5-HT引起的收縮反應（＜0.05、0.01）；降低5-HT1B受體和p-ERK1/2蛋白表達（＜0.05、0.01），增加SIRT1蛋白表達（＜0.01）。白藜蘆醇通過SIRT1-ERK1/2信號通路下調5-HT受體，從而抑制CsA誘導的高血壓。

白藜蘆醇；高血壓；環孢菌素A；5-羥色胺；沉默信息調節因子1

環孢菌素A（cyclosporine A，CsA）是臨床上常用于預防器官移植排斥的免疫抑制劑，可防止器官移植患者體內的免疫排斥，在器官移植治療中發揮了重要的作用[1-2]。目前臨床上CsA也被用于治療類風濕性關節炎、再生障礙性貧血等自身免疫性疾病[3-6]。伴隨著CsA的廣泛使用，也暴露出較多的不良反應，高血壓是CsA重要的不良反應，臨床研究表明使用CsA的腎臟移植患者中高血壓發生率高達20%～25%[7-8]。CsA可以引起人和動物的血壓升高，然而其機制尚不清楚[9-10]。

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是一種內源性的神經遞質，5-HT可以引起血管收縮，通過激活5-HT1B等受體介導血管收縮[11]。研究表明，在蛛網膜下腔出血、腦缺血以及高血壓等病變中，5-HT1B受體的表達上調[12-13]。臨床上化學藥雖然降壓效果顯著、療效肯定，但仍有部分患者血壓不能得到有效的控制，也會產生一些嚴重的不良反應，如利尿降壓藥可引起電解質紊亂，血管緊張素轉換酶抑制劑引起干咳，鈣通道阻滯劑引起心率失常，α受體阻滯劑引起體位性低血壓等[14-15]。某些中藥單體、中藥提取物和中藥復方等均可降低血壓，降壓作用緩和，且可以改善各類癥狀[16-17]；在降壓的同時，還具有改善微循環、調血脂、抗氧化、保護血管內皮、調節血管活性物質等多重作用，具有廣闊的應用前景。

白藜蘆醇多存在于藜蘆、虎杖、葡萄、花生等植物中，屬于一種多酚類天然化合物，不僅有較強的心血管保護作用，還具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗衰老和抗神經退行性疾病等重要的藥理作用[18-21]。研究表明，白藜蘆醇可以舒張血管、降低血壓[22-23]。然而，白藜蘆醇對CsA引起的高血壓作用及其機制尚不清楚。本研究通過離體動脈培養模型和CsA誘導大鼠高血壓模型，探究白藜蘆醇對大鼠血壓的影響及其相關機制，為CsA引起的高血壓的預防和治療提供新的思路與依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，6～8周齡，由西安交通大學實驗動物中心提供，實驗動物生產（使用）許可證號SCXK（陜）2020-001。動物飼養于陜西中醫藥大學中藥藥理實驗室，室溫（23±2）℃，光照周期為12 h，飼養期間動物自由進食飲水。動物實驗經陜西中醫藥大學倫理委員會批準（批準號SUCMDL20201119001）。

1.2 藥品與試劑

CsA（批號S17068）、白藜蘆醇（批號S30630，質量分數為98%）購自上海源葉生物科技有限公司；5-HT（批號Slcf8396）、乙酰膽堿（acetyl choline，ACh，批號BCBX5660）、細胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）特異性抑制劑U0126（批號19826）、Triton X-100（批號T8787）購自美國Sigma公司；5HT1B受體抗體（批號AB13896）、沉默信息調節因子1（sirtuin 1，SIRT1）抗體（批號AB12193）購自英國Abcam公司；ERK1/2（批號4695S）、磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）抗體（批號4370S）購自美國CST公司；β-actin抗體（批號66009-1-Ig）購自武漢博士德生物工程有限公司；HRP標記的山羊抗兔二抗（批號A0280）購自上海碧云天生物技術有限公司；青霉素/鏈霉素溶液（批號J190033）購自美國HyClone公司。

1.3 儀器

CODA動物無創血壓測量系統（美國Kent公司）；DMT 630M型離體微血管張力測定系統（丹麥DMT公司）；CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；肌張力描記記錄系統（澳大利亞ADI公司）；電泳儀、轉膜儀、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 腸系膜動脈血管離體培養

SD大鼠斷頸處死，無菌條件下迅速分離出大鼠腸系膜，浸泡于經濾過除菌并預冷的Na+-PSS緩沖液（119 mmol/L NaCl、15 mmol/L NaHCO3、4.6 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgCl2、1.2 mmol/L NaH2PO4、1.5 mmol/L CaCl2和5.5 mmol/L葡萄糖）中，于體視顯微鏡下分離出腸系膜動脈，0.1% Triton X-100血管內灌注10 s，去除血管內皮，腸系膜動脈剪成2 mm的動脈環，放入24孔培養板內進行培養，每孔加入1 mL不含血清的DMEM高糖培養基，在培養基中加入CsA（1×10?6、1×10?5mol/L）或二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）或U0126（1×10?6mol/L）或白藜蘆醇（1×10?5、1×10?4mol/L）。培養板置于37 ℃、5% CO2的培養箱內，培養24 h。

2.2 離體培養的腸系膜血管收縮功能檢測

將5 mL Na+-PSS加入恒溫離體浴槽內，并將含95% O2和5% CO2的混合氣體不斷通入浴槽內，將分離的動脈環穿入2根20 μm的金屬絲，其中一根金屬絲與可調節預張力的張力微調裝置相連，另一根連接張力換能器。固定好的動脈環平衡40 min后，每15分鐘施加0.5 mN的預張力，直至2 mN，加入60 mmol/L K+-PSS緩沖液（119 mmol/L KCl、15 mmol/L NaHCO3、4.6 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgCl2、1.2 mmol/L NaH2PO4、1.5 mmol/L CaCl2和5.5 mmol/L葡萄糖）檢驗動脈環收縮活性，若動脈環在2次K+-PSS緩沖液中的收縮幅度均大于5 mN并且2次收縮差異低于10%時，該動脈環用于后續實驗，使用ACh檢測動脈環內皮是否完全去除。將5-HT受體特異性激動劑5-HT按濃度累加法的方式，由低至高濃度（1×10?8～1×10?4mmol/L）依次加入DMT浴槽中來觀察大鼠血管收縮功能[24]。

2.3 動物分組、給藥和造模

24只SD大鼠隨機分為對照組、模型組和白藜蘆醇低、高劑量（75、150 mg/kg）組，每組6只。除對照組sc大豆油外，其余各組sc CsA（25 mg/kg）；各給藥組再ig相應藥物，對照組ig等體積0.5%羧甲基纖維素鈉[9,25]，1次/d，連續21 d。

2.4 大鼠無創血壓測量

每周采用CODA無創血壓儀測量系統記錄大鼠清醒狀態下尾動脈的收縮和舒張壓，每個時間點重復測量15～30次，取其平均值。

2.5 大鼠腸系膜血管收縮功能檢測

給藥21 d后，大鼠處死，迅速取出腸系膜動脈，浸入預冷的Na+-PSS緩沖液中，于顯微鏡下快速剝離腸系膜動脈周圍黏附組織，將分離的腸系膜動脈剪切成長約2 mm的動脈環，使用離體肌張力記錄系統檢測動脈張力的變化。

2.6 Western blotting檢測5HT1B受體、ERK1/2、p-ERK1/2和SIRT1蛋白表達

取大鼠腸系膜動脈，加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法檢測樣品蛋白含量，制備的蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于含5%脫脂牛奶的TBST中室溫封閉2 h，分別加入相應一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜后用ECL發光試劑顯影，檢測目標條帶的灰度值，分析相關蛋白表達。

2.7 統計學處理

3 結果

3.1 CsA對5-HT受體介導的收縮反應的影響

為了研究不同濃度的CsA對5-HT收縮的影響，將CsA（1×10?6、1×10?5mol/L）[26]分別與離體動脈血管共培養24 h，梯度累加法加入5-HT，獲得累積濃度-反應曲線見圖1，不同濃度的CsA均顯著增強腸系膜動脈收縮功能，收縮量效曲線明顯左移。與DMSO組相比，1×10?5mol/L CsA可以明顯增強5-HT的收縮作用，Emax明顯升高（＜0.05、0.01）。

與DMSO組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.2 U0126對5-HT受體介導的收縮反應的影響

為了考察ERK1/2通路是否參與了CsA誘導的腸系膜動脈收縮增強，在培養時加入特異性ERK1/2信號通路抑制劑U0126（1×10?6mol/L）與CsA共培養24 h[24]，結果如圖2-A所示，與CsA組相比，U0126可以顯著抑制5-HT誘導的收縮反應（＜0.05、0.01）；Western blotting結果（圖2-B）顯示，與DMSO組比較，CsA組p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與CsA組比較，U0126顯著抑制p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達（＜0.01）。表明ERK1/2-絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路可能參與了CsA引起的血管收縮。

與DMSO組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與CsA組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.3 白藜蘆醇對5-HT受體介導的收縮反應的影響

為了研究白藜蘆醇對CsA誘導的血管平滑肌收縮功能的影響，將白藜蘆醇（1×10?5、1×10?4mol/L）與CsA共培養24 h。如圖3-A所示，與CsA相比，白藜蘆醇顯著抑制5-HT誘導的收縮反應（＜0.01）；Western blotting結果（圖3-B）顯示，CsA顯著降低SIRT1蛋白表達水平（＜0.05），而白藜蘆醇（1×10?4mol/L）可以顯著上調SIRT1蛋白表達水平（＜0.05）。提示白藜蘆醇可能通過激活SIRT1通路抑制CsA誘導的收縮。

3.4 白藜蘆醇對CsA誘導大鼠血壓的影響

為了研究白藜蘆醇對CsA誘導的高血壓大鼠收縮壓和舒張壓的影響，在給藥前和給藥期間平均每周測血壓1次。如圖4所示，給藥前（第0周）各組大鼠收縮壓和舒張壓均無顯著性差異；給藥1周后，給予CsA后大鼠收縮壓和舒張血壓均升高，與對照組相比，第3周模型組收縮壓和舒張壓均有顯著性差異（＜0.01）；與模型組相比，第3周白藜蘆醇高劑量組大鼠收縮壓與舒張壓均顯著降低（＜0.05、0.01）。

與DMSO組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與CsA組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同 1 mm Hg＝133 Pa

3.5 白藜蘆醇對5-HT介導的收縮反應和5-HT1B受體蛋白表達的影響

如圖5-A和表1所示，與對照組比較，模型組5-HT介導的大鼠腸系膜動脈收縮反應明顯增強（＜0.01），Emax顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇高劑量組顯著抑制血管收縮反應量效曲線（＜0.01），Emax顯著降低（＜0.01），表明白藜蘆醇可以抑制CsA引起的血管收縮。Western blotting結果（圖5-B）表明，與對照組比較，模型組5-HT1B受體蛋白表達水平明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇高劑量組5-HT1B受體蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）。

圖5 白藜蘆醇對5-HT介導的血管收縮反應(A)和5-HT1B受體蛋白表達 (B)的影響(n = 6)

表1 白藜蘆醇對5-HT誘導動脈環收縮的Emax和pEC50的影響(, n = 6)

Table 1 Effect of resveratrol on Emax and pEC50 of 5-HT-induced arterial ring contraction (, n = 6)

組別劑量/(mg·kg?1)Emax/%pEC50 對照—187.90±11.065.680±0.098 模型—256.30±16.85**5.440±0.098* 白藜蘆醇75228.80±16.12#5.450±0.100 150206.20±17.29##5.570±0.130#

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group

3.6 白藜蘆醇對大鼠腸系膜動脈SIRT1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達的影響

為了研究SIRT1和ERK1/2通路是否參與了白藜蘆醇降低大鼠腸系膜動脈高反應性的過程，檢測了SIRT1和p-ERK1/2蛋白表達，如圖6所示，與對照組比較，模型組SIRT1蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇高劑量組SIRT1蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），白藜蘆醇低、高劑量組p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01），表明SIRT1和ERK1/2- MAPK信號通路可能參與了白藜蘆醇抑制CsA上調5-HT1B受體引起的血管收縮。

圖6 白藜蘆醇對大鼠腸系膜動脈SIRT1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達的影響(n = 6)

4 討論

高血壓是CsA臨床使用中最常見的不良反應，高血壓會促使左心室肥大、動脈粥樣硬化、心力衰竭，高血壓也通常會導致移植器官存活率大幅度下降，甚至可能導致死亡[27-28]，因此，需要積極地干預CsA引起的高血壓。白藜蘆醇是一種多酚類化合物和植物抗毒素，作為SIRT1的激動劑，具有較好的抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、調節脂質代謝、舒張血管、防止心肌纖維化和心室肥厚及電生理效應等作用，從而發揮對心血管系統的保護作用[18]。白藜蘆醇對自發性高血壓、血管緊張素II引起的高血壓模型、腎性高血壓模型和同型半胱氨酸引起的高血壓等許多動物模型均具有降壓作用[29-31]。然而，白藜蘆醇對CsA引起高血壓的影響未見報道。本研究通過離體血管培養技術考察了白藜蘆醇對CsA誘導的血管收縮功能的影響，并通過CsA誘導大鼠高血壓模型考察了白藜蘆醇對大鼠血壓的影響，從大鼠腸系膜動脈平滑肌收縮功能和蛋白表達闡述了白藜蘆醇降低CsA引起高血壓的作用機制。研究結果表明，CsA可顯著升高大鼠血壓，增強腸系膜動脈平滑肌的5-HT受體介導的收縮反應，該現象可能與CsA上調5-HT受體相關。白藜蘆醇可以降低CsA誘導的高血壓，并且抑制CsA引起的血管高反應性和減少5-HT1B蛋白的表達，白藜蘆醇可能通過激活SIRT1、抑制ERK1/2通路減弱血管收縮作用從而降壓。

高血壓病理狀況下血管平滑肌收縮性受體明顯上調，使血管對激動劑產生高反應性；下調血管平滑肌收縮性受體能夠降低血管的高反應性，從而降低血壓[32-33]。研究發現，5-HT誘導的急性血管收縮主要由5-HT1B受體介導，而長期暴露于5-HT可通過激活5-HT1B受體引起肺動脈高壓，自發性高血壓大鼠動脈平滑肌細胞上的5-HT受體表達增強[34-35]。在血管收縮功能研究中，白藜蘆醇可以顯著降低5-HT誘導的大鼠腸系膜動脈收縮，Western blotting結果顯示白藜蘆醇顯著下調大鼠腸系膜動脈5-HT1B受體的表達，提示白藜蘆醇通過下調血管平滑肌上的5-HT受體表達，降低血管高反應性，從而降低血壓。

MAPK信號通路能夠調控細胞內多種生物信號轉導。ERK1/2信號通路將信息從細胞表面傳遞到細胞內，再轉導到細胞核，激活轉錄因子，介導生物學效應[36-37]。研究表明，吸煙與低密度脂蛋白等危險因子損傷動脈平滑肌，激活ERK1/2信號轉導通路介導的轉錄和翻譯機制，合成新的5-HT受體，使動脈血管平滑肌5-HT受體表達上調，導致動脈血管敏感性增強，呈高反應性[38-39]。U0126是ERK1/2通路特異性抑制劑，阻斷絲裂原活化的細胞外信號調節激酶1/2（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1/2，MEK1/2）激活，抑制下游ERK1/2激酶激活。CsA增強血管收縮的作用及上調5-HT受體的表達可以被ERK1/2通路抑制劑U0126抑制，表明CsA上調5-HT受體的作用可能與ERK1/2信號通路有關。激活SIRT1可以降低血壓，研究表明SIRT1的激活可以保護血管，降低血管的收縮作用，從而降低血壓[40]。SIRT1激活劑白藜蘆醇能夠通過SIRT1介導的信號轉導途徑改善高血壓。本研究結果表明，CsA抑制SIRT1表達，激活ERK1/2信號通路，而白藜蘆醇可以激活SIRT1，抑制ERK1/2通路而降低血管高反應性。

綜上所述，本研究發現白藜蘆醇能夠激活SIRT1，抑制ERK1/2信號通路，下調5-HT受體的表達，改善腸系膜動脈高反應性，降低CsA引起的高血壓。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of resveratrol on cyclosporin A-induced hypertension based on SIRT1-ERK1/2 pathway

WANG Chuan1, 2, WANG Yu-ying1, WANG Ting1, SHI Yong-heng1, 2, LIU Ji-ping1, 2, WANG Bin1, 2, WEI Hao1, 2, LIU Hang3

1.College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 2.Key Laboratory of Pharmacodynamics and Material Basis of Chinese Medicine, Shaanxi Administration of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 3.Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, China

To study the effect and mechanism of resveratrol on cyclosporine A (CsA) induced hypertension.organ culture and myograph were used to study CsA induced vasoconstrictions mediated by 5-hydroxytryptamine (5-HT) receptor.Rats were sc CsA to induce blood pressure increased, and resveratrol was given for intervention to study the effect of resveratrol on blood pressure; Microvascular tonometry was used to observe the changes in dose-response curve of arterial contraction caused by 5-HT; Western blotting was used to detect 5-HT1Breceptor, sirtuin 1 (SIRT1) and extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) protein expressions.The results of isolated blood vessel culture showed that resveratrol inhibited CsA-induced contraction by activating SIRT1-ERK1/2 pathway.Animal experiments showed that resveratrol could significantly reduce the increase in blood pressure caused by CsA (< 0.05, 0.01); Inhibited the contractile response caused by 5-HT (< 0.05, 0.01); Decreased the expressions of 5-HT1Breceptor and p-ERK1/2 protein (< 0.05, 0.01), and increased the protein expression of SIRT1 (< 0.01).Resveratrol can inhibit CsA-induced hypertension by down-regulating 5-HT receptor through SIRT1-ERK1/2 signaling pathway.

resveratrol; hypertension; cyclosporin A; 5-hydroxytryptamine; sirtuin1

R285.5

A

0253 - 2670(2022)09 - 2723 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.015

2022-01-18

國家自然科學基金資助項目（81800401）；陜西省科技廳一般項目——社會發展領域（2022SF-207，2022SF-435）；大學生創新創業訓練計劃項目（S202010716021，S202010716024）；陜西中醫藥大學學科創新團隊（2019-YL13）

王 川（1987—），男，副教授，博士研究生，主要從事心血管疾病的發病及防治研究。E-mail: wangchuan@sntcm.edu.cn

通信作者：劉 航（1983—），男，主管中藥師，主要從事中藥制劑工藝研究。E-mail: 497240346@qq.com

[責任編輯 李亞楠]