牛場辣椒的全基因組SNP標記分析

黃冬福， 何建文， 江葉莎， 付文婷， 范高領， 吳 迪， 詹永發, 石燕金， 王楠藝

(1.貴州省農業科學院辣椒研究所， 貴陽 550009； 2.遵義市農業農村局， 貴州 遵義 563000)

辣椒為茄科辣椒屬植物，有極大的利用價值，營養價值高可鮮食，是一種重要的調味品，富含的辣椒堿具有一定的藥用價值，辣椒紅素可用于食品及化妝品的著色。貴州六枝特區的牛場辣椒于2014年被認定為國家地理標志產品，具有果色深紅，肉厚，辣味適中，香氣濃郁等優異品質[1]。辣椒基因組上含有多種分子標記。在眾多的分子標記中，SNP(單核苷酸多態性)最重要且最具吸引力，其高水平的多態性、共顯性、高通量、豐富的信息量[2]廣泛用于作物育種中的遺傳多樣性分析、基因組關聯分析及比較基因組學[3-6]。

國內外研究者獲得了辣椒的大量SNP標記。Siddique等[7]對188個辣椒重組自交系個體和352個辣椒材料進行重測序，開發了666 405個SNP標記，結合經典的QTL定位和全基因組關聯分析，獲得了3個賦予疫病廣譜抗性的主效QTL。Wu等[8]對287個辣椒材料進行重測序，獲得了9 557 790個SNP，通過全基因組關聯分析，發現調控26個辣椒農藝性狀的2 126個候選基因。Wang等[9]對辣椒不育系和保持系的線粒體基因組測序，獲得了兩者間的112個SNP，結合已知的CMS(細胞質雄性不育)基因特征，篩選出2個最有可能決定CMS的ORF。Han等[10]對208份辣椒材料進行重測序，開發了109 610個SNP標記，發現99個SNP與辣椒素顯著關聯。孫茜[11]對辣椒抗感黃瓜花葉病毒(CMV)的基因池進行重測序，獲得了51 969 152個SNP標記，結合關聯分析和經典的QTL定位，發現了抗CMV的1個主效QTL和2個微效QTL。趙紅[12]對349份國內辣椒核心種質進行重測序，平均每份種質獲得了7 425 498個SNP，通過全基因組關聯分析，發現94個SNP與果實辣味等20個性狀顯著關聯。

就目前的研究來看，各研究者開發了大量辣椒SNP標記，但是所用品種沒有涉及牛場辣椒，而利用已有的SNP標記重新篩選牛場辣椒特異的SNP費時費力且無法保證數量與質量。另外，各研究者開發SNP采用的是簡化基因組測序法，基于此法開發的SNP無法覆蓋全基因組，SNP的數量及密度遠不如全基因組測序法。因此，本研究利用全基因組重測序分析牛場辣椒的SNP標記，為牛場辣椒遺傳圖譜構建、重要農藝性狀基因挖掘、遺傳改良、品種鑒定與保護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

牛場辣椒(CapsicumannuumL.)，2014年被農業部認定為地理標志農產品，由貴州省辣椒研究所保存。取苗期的葉片用于全基因組重測序。

1.2 基因組DNA提取與DNA質量檢測

采用DNA secure Plant Kit(TIANGEN)試劑盒提取基因組DNA；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA是否降解和污染；NanoPhotometer?spectrophotometer (IMPLEN, CA, USA)檢查 DNA 純度；使用2.0 Flurometer (Life Technologies, CA, USA)檢測DNA 濃度。

1.3 測序文庫構建

分別取檢測合格的DNA 樣品700 ng，通過Covaris破碎機打斷成長度為350 bp的片段，使用NEB Next?Ultra DNA Library Prep Kit(NEB, USA)構建文庫，并將index codes添加到每個測序樣本中。使用AMPure XP系統(Beckman Coulter，Beverly，USA)純化DNA，DNA片段的3′末端腺苷酸化后，連接具有發夾環結構的NEB下游銜接子以準備雜交；PCR反應前使用電泳來選擇指定長度的DNA片段，在USER酶(NEB，USA)的作用下，37 ℃ 15 min、95 ℃ 5 min；然后用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶、Universal PCR引物和Index(X)引物進行PCR， PCR產物用AMPure XP系統進行純化。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0軟件進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，隨后使用Agilent Bioanalyzer 2100軟件對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2 nmol/L)，保證文庫質量。

1.4 全基因組測序和質量控制

利用Illumina HiSeq 2000平臺進行全基因組測序，測序生成的原始圖像數據文件經堿基識別轉化為原始測序序列(Illumina pipeline CASAVA v 1.8.2)，然后通過質量控制去除以下不能用的reads，且兩端reads均去除：

1) 帶文庫構建接頭的reads；

2) 未知堿基超過10%的reads；

3) 低質量堿基(測序質量值≤5)超過50%的reads。

1.5 序列比對

質控后的有效測序數據經BWA軟件比對到參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10896，v1.0)，比對結果經SAMTOOLS和PICARD軟件(http://picard.sourceforge.net)去除重復。

1.6 變異檢測及注釋

設定參數(-q 1-C 50-m 2-F 0.002-d 1000)，用samtools軟件檢測原始的SNP，然后用如下標準進行過濾：

1) 變異位置的測序深度>4；

2) 質量值>20。

用ANNOVAR軟件對SNP進行變異注釋。

2 結果與分析

2.1 測序數據產出及與參考基因組比對分析

由表1可知，經過全基因組重測序，共獲得785 408 260條Raw reads，平均讀長150 bp，堿基總長為117.8 Gb；通過質量控制去除帶接頭的reads、未知堿基超過10%的reads以及低質量(Q值≤5)堿基數超過50%的reads，得到高質量的clean reads；clean reads共有783 349 390條，覆蓋98.23%的基因組；去除clean reads中的非特異reads，獲得771 948 477條有效reads，其中758 748 158條reads能錨定到“遵辣1號”參考基因組上，配對率為98.29%，平均測序深度為36.35×。

表1 牛場辣椒測序數據產出及與參考基因組比對情況Table 1 The sequencing data of Niuchang pepper and the result compared with the reference genome

2.2 染色體上SNP的分布規律和特征

根據與參考基因組的比較，SNP分為純合和雜合類型，分別占SNP總數的59.12%、40.88%。每條染色體上的SNP總數不同，10號染色體上SNP總數最多(1 371 387個)，4號染色體上SNP總數最少(349 894個)。每條染色體上純合和雜合SNP的數量也不同， 10號染色體上的純合SNP最多(889 193個)，9號染色體上的純合SNP最少(169 010個)，9號染色體上的雜合SNP最多(779 326個)，4號染色體上的雜合SNP最少(93 614個)，具體見表2。

每條染色體上密度最高區域SNP出現頻率不同，10號染色體上密度最高區域SNP出現頻率最高(1 904個/100 kb)，4號染色體上密度最高區域SNP出現頻率最低(1 162個/100 kb)，具體見表3和圖1。

表2 每條染色體上SNP的數量Table 2 The number of SNP on each chromosome

表3 每條染色體上SNP密度最高區域及其出現頻率Table 3 The frequency of SNP in highest SNP densityarea of chromosomes

2.3 基因組不同位置SNP分布特征

牛場辣椒基因組中的SNP分布在5個不同位置：基因上游、基因內、基因下游、基因上游/下游、基因間。(基因上游是指基因上游1 kb區域；基因內指基因內部；基因下游指基因下游1 kb區域；基因上游/下游指基因上游1 kb區域，同時也在另一基因的下游1 kb區域；基因間指兩個基因間區)。5個不同位置的SNP數量不同且差異顯著，SNP數量從多到少依次為基因間>基因內>基因上游>基因下游>基因上游/下游(表4)，基因間、基因內、基因上游、基因下游的SNP占比依次為94.68%、3.64%、0.9%、0.74%(圖2)。

基因內不同位置所含SNP數量也不同，基因內包含外顯子、內含子、剪接位點3個位置，所含SNP數量分別為51 242、281 002、288個，SNP數量從多到少依次為內含子、外顯子、剪接位點。針對外顯子區域，根據SNP變異引起的密碼子變化， 可將SNP分為4種類型：終止子獲得、終止子缺失、同義突變、非同義突變，數量分別為710、188、19 079和31 265，SNP數量依次為非同義突變>同義突變>終止子獲得>終止子缺失。

圖1 每條染色體上的SNP密度熱圖 Fig.1 The density heat map of SNP on each chromosome

圖2 牛場辣椒基因組中不同位置的SNP數量差異Fig.2 The number difference of SNP on the different position in the genome of Niuchang pepper

表4 牛場辣椒基因組中SNP的位置及相應數量Table 4 The position and corresponding number of SNP in the genome of Niuchang pepper

2.4 SNP突變頻譜

全基因組SNP突變可分為6類：T∶A>G∶C，T∶A>C∶G，T∶A>A∶T，C∶G>T∶A，C∶G>G∶C和C∶G>A∶T。以T∶A>C∶G為例，此種類型SNP突變包括T>C和A>G。由于測序數據既可比對到參考基因組的正鏈，也可比對到參考基因組的負鏈，當T>C類型突變出現在參考基因組正鏈上，A>G類型突變即在參考基因組負鏈的相同位置，所以將T>C和A>G劃分成一類。C∶G>T∶A的數量最多(3 109 688個)，C∶G>G∶C的數量最少(474 542個)。T∶A>G∶C、T∶A>A∶T、C∶G>G∶C、C∶G>A∶T為顛換，總數為3 057 408個，T∶A>C∶G及C∶G>T∶A為轉換，總數為6 094 214個，發生轉換的數量是顛換的1.99倍(圖3)。

圖3 SNP突變頻譜Fig.3 The mutation frequency and type of SNP

3 討論與結論

3.1 基于WGRS技術開發辣椒SNP標記的高效性

辣椒全基因組序列的公布為其分子育種帶來前所未有的機遇。想要開展辣椒分子育種，就必須對群體中所有個體進行基因分型。利用傳統方法對辣椒進行基因分型費用高、耗時耗力，低水平的分子標記也是基因分型的重要挑戰?；谛乱淮鷾y序技術(NGS)的基因分型通量高、成本低、分子標記密度高。

全基因組重測序(WGRS)是新一代測序技術(NGS)的一種。利用WGRS技術開發分子標記具有標記密度大、有效標記多、準確率和特異性高、穩定性好的優勢。本研究利用WGRS技術共鑒定出9 141 358個SNP，SNP的出現頻率為1個/366 bp，其中51 242個SNP位于外顯子。Ahn利用WGRS技術獲得了6 840 889個辣椒SNP，其中39 955個SNP位于外顯子[13]。

相比而言，利用簡化基因組測序開發SNP標記的效率較低。Nimmakayala等[14]利用簡化基因組測序僅獲得66 960個辣椒SNP，SNP的出現頻率為1個/40.7 kb，其中僅有2 521個SNP位于外顯子。Nimmakayala等[15]采用簡化基因組測序獲得77 407個辣椒SNP，SNP的出現頻率為1個/35.6 kb，其中26 697個SNP位于外顯子。由此可見，利用WGRS獲得的SNP標記數量、出現頻率、外顯子上的SNP數量遠高于簡化基因組重測序[14-15]。

功能標記是分子標記的一種，基于功能基因內的多態序列開發，與常規的分子標記相比，與表型的連鎖程度更緊密[16]，外顯子上的SNP最可能作為功能標記。因此，通過檢測功能標記能更準確地預測表型，在加速育種進程的同時極大地提高了標記輔助選擇的準確性。本研究獲得的51 242個外顯子SNP作為潛在的功能標記，將成為辣椒分子育種的有力武器。

3.2 牛場辣椒SNP標記分布特征

SNP在牛場辣椒基因組上的分布表明，基因間的SNP數量比基因內多，是基因內的26倍，內含子區域的SNP數量比外顯子多，是外顯子區域的5.5倍，這種分布規律與Kim等[17]的研究結果相似。外顯子上，SNP引起的終止子獲得有710處，終止子獲得是指堿基突變導致終止密碼子提前出現。其產生截短的蛋白質，從而使基因散失原來的功能，并進一步引發作物表型變異。因此，終止子獲得對基因功能研究具有重要意義。AFS1基因發生5 bp缺失及G/A轉換，翻譯提前終止，導致水稻小穗異常，小穗上多出一個外稃狀器官，內稃發生不同程度的退化[18]。GmSG基因發生A/G轉換，翻譯提前終止，導致大豆種皮顏色由黃色轉變為黃/綠色[19]。SNFL1基因單內含子上最后一個堿基發生單核苷酸突變，翻譯提前終止，導致水稻旗葉變短變窄[20]。OsCUL 3 a蛋白翻譯提前終止，導致水稻flg 22、幾丁質誘導的活性氧、發病相關基因的表達量明顯增加，進而產生類病斑[21]。

本研究發現,牛場辣椒10號染色體上的SNP數量最多，且18.17%的純合SNP位于該染色體上，4號染色體上的SNP數量最少，與Nimmakayala[15]的研究結果不同，Nimmakayala的研究顯示辣椒3號染色體上SNP數量最多，9號染色體上SNP數量最少，與Ahn[13]的研究結果也不同，Ahn的研究顯示辣椒品種PRH 11號染色體上SNP數量最多，8號染色體上SNP數量最少。造成不同染色體上SNP分布頻率差異的原因可能是不同研究者使用的辣椒品種不同。

SNP引起的點突變可分為轉換和顛換?，F有研究表明，人類基因組CpG中的胞嘧啶C能自發脫氨基變成胸腺嘧啶T，導致C∶G>T∶A的轉換比T∶A>C∶G的轉換多，同時，轉換比顛換更容易發生，且轉換的SNP是顛換的2倍[22]。牛場辣椒C∶G>T∶A的轉換比T∶A>C∶G的轉換多，且轉換的SNP數量明顯高于顛換，是顛換的1.99倍，與前人的研究結果基本一致。

本研究對牛場辣椒進行全基因組重測序，獲得了9 141 358個SNP，SNP的出現頻率為1個/366 bp，展示出WGRS技術開發辣椒SNP標記的高效性；其中51 242個SNP位于外顯子上，外顯子上的SNP具有開發成功能標記的巨大潛力，功能標記與表型的連鎖程度更緊密，能極大地提高標記輔助選擇的準確性，是辣椒分子育種的有力武器；外顯子上的SNP產生了710處終止子，終止子獲得會產生截短的蛋白質，使基因散失原來的功能，并進一步引發作物表型變異，對基因功能研究具有重要意義。