過度勞累對大鼠動脈血管壁細胞外基質的影響

陳蘇衡，甘 露，莊 苗，張小曉，郭 鴻，黃蓉蓉，李玉蘭

1蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000 2蘭州大學第一醫院麻醉科，蘭州 730000

近年來，全球各行業“過勞死”頻繁發生，引起社會的廣泛關注?！斑^勞死”是因為工作時間過長、勞動強度過重、心理壓力太大引發的亞健康狀態，由于積重難返，可能誘發身體潛在的疾病突然惡化，救治不及時會危及生命[1]。據不完全統計，我國每年有約60萬人死于過度勞累(overwork，OW)，居世界首位。過勞死已成為我國現階段非常嚴重的社會問題之一，亟待社會學和醫學層面的系統研究[2]。既往研究表明，OW狀態引起猝死的主要原因是心腦血管疾病，如腦出血、腦梗死、心肌梗死等[3]；OW狀態增加體內兒茶酚胺和皮質醇的分泌，導致動脈粥樣硬化的進展、心血管疾病和腦卒中的風險增加[4]，且長時間工作與中風具有明顯的劑量-反應關系[5]。對青年猝死者進行法醫學檢查時，在其腦血管、冠狀血管及主動脈上升部均可發現明顯的形態學改變[6]，表現為血管壁結締組織紊亂、扭曲或結締組織成分置換的改變[7]，以細胞外基質(extracellular matrix，ECM)結構排列紊亂與ECM的沉積為著。ECM的異常沉積或成分改變會使血管壁發生重塑，血管重塑是對衰老和血管疾病相關的各種病理生理變化的適應性反應，血管重塑與心腦血管疾病的發展進程密切相關[8- 9]。本研究擬建立大鼠OW模型[10]，檢測OW對大鼠動脈壁病理、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)相關基因、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissueinhibitor of metalloproteinase，TIMP)相關基因與Ⅰ型膠原纖維(collagen 1，Col- 1)基因、蛋白的影響，探討OW引起血管病變的可能性。

材料和方法

動物與分組健康清潔級成年雄性Sprague-Dawley大鼠18只，體重180～220 g，由蘭州大學實驗動物中心提供，采用隨機數字分組法分為3組：對照組、OW組、睡眠限制(sleep deficiency，SD)+OW組，每組6只。SD+OW組的設立用于觀察在OW的基礎上，相對較少的睡眠時間是否可以進一步加重動脈血管壁的變化，睡眠時間限制的方法使動物模型更接近于人類的工作狀態。實驗于蘭州大學實驗動物中心進行，實驗前適應性飼養1周，飼養室溫24 ℃、濕度45%～65%，喂食標準飼料，自由攝食水。

主要試劑與材料Masson改良三色染色試劑盒、EVG染色試劑盒均購自北京索萊寶公司，二步法免疫組織化學法檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，兔抗Ⅰ型膠原蛋白多克隆抗體購自中國武漢三鷹生物有限公司，臺式高速冷凍型微量離心機為中國大龍興創實驗儀器有限公司生產，熒光定量PCR儀、超微量分光光度計均為美國賽默飛世爾科技公司生產，超凈工作臺為中國蘇凈安泰公司生產，光鏡為日本奧林巴斯公司生產，透射電鏡為日本電子株式會社公司生產。

模型制作與處理采取強迫游泳實驗(forced swimming test，FST)建立過勞模型，FST是指將大鼠放入水中，大鼠試圖通過游泳離開水域，直至力竭的方法；本研究當大鼠完全潛入水中(鼻尖低于水平面)超過10 s不能自行浮出水面的情況連續出現3次或撈出后大鼠翻正反射消失即為完成1次FST。對照組大鼠在鼠籠中自由活動，隨意飲食，無特殊處理；OW組大鼠每日完成FST 2次，其余條件同對照組，連續15 d；SD+OW組大鼠每日完成FST 2次，在兩次游泳之間大鼠被放入水上平臺(水中平臺裝置為一35 cm×40 cm×60 cm的水槽，其內有數個高約12 cm、直徑約4 cm的圓柱形平臺，水深約10 cm)，時長為6 h，隨意飲食，連續15 d。連續15 d完成FST的大鼠即認為造模成功。第16天，用戊巴比妥鈉(1%溶液，6 μl/g，腹腔注射)麻醉大鼠，心臟取血5 ml后迅速摘取5 cm腹主動脈和1 cm頸總動脈后進行相關指標檢測。

血管壁病理形態學檢查取部分腹主動脈，在磷酸鹽緩沖液中將血管外周結締組織剝離干凈，放入4%多聚甲醛固定7 d，乙醇梯度脫水，石蠟垂直定向包埋，每段血管間斷均勻切取6片。Masson染色：取6片切片嚴格按試劑盒說明書行Masson染色，光鏡下觀察膠原纖維染色，后用Image J病理圖像分析系統定量膠原纖維含量百分比[11]；EVG染色：在磷酸鹽緩沖液中剝離頸總動脈外結締組織，放入4%多聚甲醛固定7 d，乙醇梯度脫水，石蠟垂直定向包埋，每段血管均勻切取6片進行EVG彈性纖維染色，光鏡下觀察動脈壁彈性纖維染色，用于判斷彈性纖維的完整性及結構排列，后用Image J病理圖像分析系統定量彈性纖維含量百分比。

透射電鏡觀察腹主動脈壁超微結構取部分腹主動脈，在PBS緩沖液中將血管外周結締組織剝離干凈，用2.5%戊二醛、1%鋨酸雙重固定，環氧樹脂包埋，超薄切片機切片(70 nm)，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后在透射電鏡下觀察血管壁超微結構的改變、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)與ECM的連接及彈性纖維層的形態結構和完整性。

免疫組織化學法定量分析腹主動脈Col- 1蛋白表達取部分腹主動脈石蠟垂直定向包埋后，石蠟切片機均勻切片，每片厚約4 μm；60 ℃烤片過夜；脫蠟水化；微波抗原修復；冷卻至室溫后每張切片滴加一抗50 μl(兔抗Ⅰ型膠原蛋白多克隆抗體，稀釋濃度1∶200)，4 ℃孵育過夜；然后按PV- 9000二步法檢測試劑盒滴加二抗，37 ℃溫育30 min；二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，脫水與透明后封片，封片后光鏡下觀察。光鏡下可見陽性表達呈棕黃色點狀或纖維狀染色，棕黃色面積大小可以代表蛋白表達含量的多少；每張切片選擇5個不同視野進行拍照，用Image-Pro J圖像分析軟件測量陽性染色積分光密度(integrated optical density，IOD)值以及陽性染色面積，并計算平均IOD值(mean integral optical density，MOD)(MOD=IOD/目標分布區域面積)以反映Col- 1蛋白的表達強度。

腹主動脈中MMP、TIMP、Col- 1基因表達水平測定取部分腹主動脈，在PBS緩沖液中將血管外周結締組織剝離干凈，吸干血管壁表面水分備用，取勻漿管，加入1 ml的RNA提取液，置冰上預冷，取100 mg組織，加入到勻漿管中，勻漿儀充分研磨直至無可見組織塊，使用離心半徑為8 cm的離心機，12 000 r/min離心10 min取上清；將濃度過高的RNA進行適當比例的稀釋，使其終濃度為200 mg/L；配置反轉錄反應體系后與提取RNA輕輕混勻后離心，設置反轉錄程序(25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s)；后將每個反轉錄產物配置3管，進行PCR擴增；擴增結果使用ΔΔCT法處理，表達倍數=2-ΔΔCT。最終計算得出的表達倍數反映血管壁中相關基因的表達水平。

統計學處理運用SPSS 25.0統計軟件進行統計分析，將數據進行正態性檢驗，符合正態分布的數據以均數±標準差表示，多組間比較采用ANOVA單因素方差分析，非正態分布的數據以M(P25，P75)表示，多組間比較采用Kruskal Wallis秩和檢驗，用Bonferroni檢驗校正顯著性水平進行組間比較，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

腹主動脈膠原纖維結構及含量變化對照組可見排列整齊的藍色膠原纖維，膠原纖維間可見粉色的血管平滑肌細胞；與對照組相比，OW組與SD+OW組膠原纖維排列結構無明顯變化，血管壁中層厚度增加(圖1)。Image J圖像軟件定量分析顯示， 對照組膠原纖維面積為(47.64±5.98)%，OW組為(45.27±8.65)%，SD+OW組為(43.83±4.75)%，3組中膜膠原纖維含量差異無統計學意義(P>0.05)。

OW：過度勞累；SD：睡眠限制

頸總動脈彈性纖維結構及含量變化血管壁染色后彈性纖維呈黑色，膠原纖維呈粉紅色，各彈性板層間可見散在的彈性纖維；與對照組相比，OW組與SD+OW組彈性纖維斷裂和紊亂，合并有血管壁中層厚度增加；SD+OW組彈性板層結構紊亂，彈性纖維排列雜亂無序，VSMC細胞間散在的彈性纖維減少，且彈性板層變薄(圖2)；Image J圖像軟件定量分析顯示，對照組彈性纖維面積為(19.62±2.70)%，OW組為(13.23±1.65)%，SD+OW組為(13.25±1.57)%；與對照組相比，OW組與SD+OW組彈性纖維含量均顯著下降(P均<0.001)，OW組與SD+OW組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

←：彈性板層

透射電鏡下腹主動脈的超微結構與對照組相比，OW組、SD+OW組可見彈性纖維斷裂、腹主動脈管壁厚度增加、VSMC紊亂、ECM排列結構紊亂；在SD+OW組腹主動脈觀察到蟲蛀樣或海綿狀的碎裂纖維的外觀，在同一血管橫截面的不同區域，纖維破碎和混亂的嚴重程度不同。此外，觀察到平滑肌細胞與ECM纖維連接減少(圖3)。

←：彈性纖維；：斷裂的纖維及海綿狀的碎裂纖維

血管壁Col- 1的表達實時熒光定量PCR顯示，對照組Col- 1的mRNA表達量為1.00±0.03，OW組為0.85±0.02，SD+OW組為0.82±0.02；與對照組相比，OW組、SD+OW組Col- 1 mRNA表達水平均顯著下降(P均<0.001)；OW組與SD+OW組Col- 1 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，OW組和SD+OW組黃染顆粒面積明顯減少(圖4)。定量分析顯示，對照組MOD值為0.33±0.04，OW組為0.30±0.02，SD+OW組為0.28±0.05；與對照組相比，OW組、SD+OW組Col- 1蛋白含量均顯著下降(P均<0.001)；OW組與SD+OW組Col- 1蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。

Col- 1：Ⅰ型膠原蛋白；★：管腔側

MMP與TIMP的基因表達與對照組相比，OW組、SD+OW組MMP- 1(P均<0.001)、MMP- 2(P均<0.001)的mRNA表達均顯著增加，OW組與SD+OW組MMP- 1、MMP- 2的 mRNA表達差異均無統計學意義(P均>0.05)；3組MMP- 9、TIMP- 1的mRNA表達差異均無統計學意義(P均>0.05)(圖5)。

MMP：基質金屬蛋白酶；TIMP- 1：組織金屬蛋白酶抑制劑- 1

討 論

OW引起猝死的病理機制目前尚無研究定論。本研究采用FST建立過勞模型[10]，模擬人類長期工作并間斷處于應激反應的狀態；同時結合水中平臺裝置限制大鼠的睡眠時間，使模型更加貼近人們日常的生活狀態。目前中國公民人均預期壽命是77.3年，正常大鼠壽命2～3年，實驗造模周期共15 d，造模時長相當于人類連續處于OW工作狀態1年左右。第16天造模結束，可見OW大鼠毛發失去光澤、毛發稀疏，同時伴有神情淡漠與精神狀態欠佳，認為造模成功[10]。

本研究結果顯示，OW使大鼠頸總動脈彈性纖維含量下降，血管壁的彈性板層變??；腹主動脈血管壁發生纖維斷裂，ECM失去正常的排列順序。OW使大鼠腹主動脈Col- 1的mRNA表達和蛋白表達下降。OW使大鼠腹主動脈MMP- 1、MMP- 2的mRNA表達增加。MMP的增加會引起Col- 1和彈性纖維的降解，破壞血管壁ECM的動態平衡。研究表明在OW等因素作用下，動脈血管ECM的完整性會遭到破壞，從而血管壁的穩定性下降。

大中動脈的血管壁分為3層：內膜、中膜及外膜，主要組成成分有內皮細胞、平滑肌細胞和ECM[12]。內膜連接血管腔，中膜由內、外彈性層與內膜、外膜隔開，主要由呈圓周排列的VSMC、膠原蛋白和彈性蛋白組成；中膜是血管壁的主要組成部分，是機械順應性的主要決定因素，外膜由膠原體ECM、成纖維細胞、血管周神經、淋巴管、血管和炎癥細胞組成[13]。中、大動脈血管壁中含量最多的ECM為膠原纖維和彈性纖維，二者在血管壁的結構支撐、機械性能與生化性能中發揮著不可或缺的作用。

ECM的合成與降解處于動態平衡中，MMP可降解ECM中所有的蛋白，正常生理條件下，MMP的生理活性很低，并在4個水平上受到調節，包括轉錄水平基因表達的調控、合成與分泌調節、酶原的激活及TIMP的調節；TIMP是多功能分子，不僅調控MMP活性，且具有細胞生長因子樣作用，促進成纖維細胞增生及膠原合成，使ECM沉積并抑制其降解[14]。為了研究血管壁中ECM的變化，本研究檢測血管壁含量最多的Col- 1以及在調控ECM合成降解中發揮重要作用的MMP與TIMP；MMP- 1為膠原酶的一種，主要作用底物為Ⅰ～Ⅲ型膠原纖維、纖維連接蛋白及層粘連蛋白；MMP- 2和MMP- 9屬于明膠酶一類，主要作用底物為Ⅵ、Ⅴ、Ⅶ型膠原纖維和纖維連接蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白[15]。

細胞外基質降解被認為是導致血管壁結構完整性和機械性能破壞最重要的機制，MMP是這一過程的關鍵因素。主動脈壁MMP主要來源于巨噬細胞、單核細胞和內側VSMC[16]。長時間工作會使人體處于一個慢性應激狀態，應激會使體內的氧化應激產物及炎性因子增多，同時增加腎素-血管緊張素系統的活性[17]，白細胞介素- 2、白細胞介素- 6、腫瘤壞死因子-α等促炎癥因子和血管緊張素Ⅱ的增加會對細胞外基質產生影響[18]；在氧化應激產物及炎性因子的刺激作用下，內側平滑肌細胞和巨噬細胞分泌MMP增加[19]，從而加劇細胞外基質的降解，使ECM原有的排列結構與機械性能遭到破壞；有文獻顯示炎性因子浸潤血管壁可以促進ECM中彈性纖維和膠原纖維的降解，從而促進腹主動脈瘤的發生和發展[16]。正常血管壁中，在MMP含量升高時，會同時激活TIMP，TIMP生成增加后結合MMP，使MMP活性下降，從而減少ECM的降解，以調控ECM降解與合成，達成一種新的動態平衡，即ECM重塑。伴隨這種ECM的重塑，血管壁細胞的生物學行為、血管壁形態和功能均會發生改變。

本研究同時探討了OW狀態下限制睡眠時間是否加重血管壁的損傷。結果顯示SD聯合OW與單純OW大鼠的檢測指標差異無統計學意義，表明相對減少的睡眠時間并未加重OW造成的血管壁損傷。

本研究的局限性在于僅對腹主動脈與頸總動脈進行了檢測觀察，未進一步觀察主要器官內的動脈變化；MMP與TIMP是調節細胞外基質穩態的重要系統，該研究僅檢測mRNA水平的表達，未檢測其蛋白表達水平及功能活性，不能全面評估動脈血管壁ECM的變化。

綜上，OW可造成動脈血管壁ECM中MMP- 1、MMP- 2的mRNA表達增加，Col- 1與彈性纖維的降解增多、含量減少，ECM合成與分解的動態平衡遭到破壞，加速血管壁ECM重塑，造成血管壁穩定性下降，這可能是OW引起的血管病變的病理基礎。