程序性壞死誘導劑抗腫瘤作用研究進展

趙 琪，楊利軍，鄭艷波，弓建華

1山西醫科大學藥理教研室，太原 030001 2中國醫學科學院 北京協和醫學院 醫藥生物技術研究所腫瘤室，北京 100050

細胞程序性死亡在維持組織內穩態過程中發揮著重要作用，已知的程序性死亡方式主要包括凋亡、程序性壞死、焦亡、鐵死亡等[1]。細胞凋亡是一種預防癌癥發生的天然屏障[2]，也是抗腫瘤藥物發揮作用的重要機制，凋亡耐受會促進腫瘤的發生、發展以及耐藥的產生，從而導致腫瘤治療的失敗。當凋亡機制受損時，程序性壞死作為抑制腫瘤發展的另外一道屏障，可以有效阻止腫瘤的進展[3]。程序性壞死在腫瘤生物學中的重要作用使其成為腫瘤治療的新靶標，越來越多的化合物和藥物通過誘導程序性壞死來抑制腫瘤的發展[4]。

程序性壞死特征及調節機制

壞死作為細胞死亡的一種方式，分為受調控的程序性壞死和不受調控的壞死。程序性壞死的概念最早于2005年提出[5]，當細胞發生程序性壞死時，其形態學特征與壞死相似，包括細胞膜通透性改變、細胞和細胞器腫脹、細胞質膜破裂及細胞內容物釋放等特征，但其受受體相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase，RIPK)1、RIPK3、混合系激酶區域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)等關鍵分子的調控。壞死細胞質膜的破裂還會釋放細胞內容物，這可能導致損傷相關分子模式(damage associated molecular pattern，DAMP)的暴露，并引發強烈的炎癥反應[6]。

很多刺激因素能夠引起程序性壞死，例如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族包括TNF-α、FasL和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)，以及病原體識別受體(PRR)包括TLR3、TLR4和Z-DNA結合蛋白1(ZBP1)等[1，7]。根據目前的研究，TNF-α及TNF受體1(TNF receptor1，TNFR1)調節程序性壞死的信號通路已經比較清楚[8- 11](圖1)。

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；TNFR1：腫瘤壞死因子受體1；TRADD：腫瘤壞死因子受體1型相關死亡結構域蛋白；RIPK1：受體相互作用蛋白激酶1；TRAF2/5：腫瘤壞死因子受體相關因子2/5；cIAP1/2：細胞凋亡抑制因子1/2；CYLD：去泛素化酶頭帕腫瘤綜合征蛋白；FADD：Fas相關死亡結構域蛋白；RIPK3：受體相互作用蛋白激酶3；MLKL：混合譜系激酶結構域蛋白

TNF-α與TNFR1相結合，誘導下游TNF受體相關死亡結構域蛋白(TNF-α receptor-associated death domain protein，TRADD)、RIPK1、細胞凋亡抑制因子(cellular inhibitor of apoptosis protein，cIAP)1/2、去泛素化酶CYLD及 TNFR相關因子(TNFR-associated factor，TRAF) 2/5等分子聚集形成膜相關復合物Ⅰ(Complex Ⅰ)。cIAP誘導RIPK1泛素化時，會抑制復合體Ⅱa (Complex Ⅱa)和復合體Ⅱb (ComplexⅡb，亦稱necrosome)的形成，從而阻斷RIPK1介導的細胞凋亡或程序性壞死。復合體Ⅱa由Caspase- 8、Fas相關死亡結構域蛋白(Fas-associated protein with death domain，FADD)和RIPK1等分子構成，復合體Ⅱb由Caspase- 8、FADD、RIPK1、RIPK3和MLKL等分子構成。而當CYLD使RIPK1去泛素化時可以促進復合物Ⅱa和Ⅱb的組裝[12]，CYLD對RIPK1的去泛素化對壞死體組裝和激活至關重要[13]。

如果在ComplexⅡa內Caspase- 8活化，則切割破壞RIPK1及RIPK3，阻斷程序性壞死通路，同時外源性凋亡通路被激活，最終導致細胞凋亡。如果此時抑制了Caspase- 8的活性，則會影響Caspase- 8的功能，使得RIPK1以及RIPK3無法被完全清除。此時RIPK1和RIPK3通過磷酸化形成ComplexⅡb，其構型就會發生變化，導致結合更加緊密。而后ComplexⅡb將向下游傳遞信號，MLKL已被確定為RIPK3的下游底物，RIPK3介導的MLKL磷酸化促進MLKL寡聚和膜定位，最終會導致細胞膜破裂[14- 15]。因此，Caspase- 8是否激活及RIPK1和RIPK3之間的相互作用可以稱為“切換開關”，最終激活凋亡或程序性壞死。

程序性壞死與腫瘤之間的聯系

程序性壞死具有促進和抑制腫瘤生長的雙重作用[16]。在誘導凋亡失敗的細胞中，程序性壞死可以作為細胞死亡的替代途徑阻止腫瘤的發展。然而，作為一種誘導細胞壞死的死亡方式，程序性壞死可觸發炎癥反應，進而促進腫瘤的發生和轉移。

一方面，誘導程序性壞死可以抑制腫瘤的發展。在不同類型的癌細胞中發現了程序性壞死信號通路中許多關鍵分子的下調，這表明癌細胞可能通過逃避壞死而存活。在許多癌細胞系中，RIPK3表達缺失或減少[17]。在患有黑色素瘤、胰腺癌和宮頸鱗狀細胞癌的患者中，低水平的MLKL與總體生存率降低有關[18]。這些發現表明，RIPK3和MLKL是重要的腫瘤抑制因子，且與腫瘤預后密切相關?；谶@些研究，通過激活或恢復程序性壞死相關信號通路，可能作為治療癌癥的一種方法。另一方面，程序性壞死也可以促進腫瘤的發生和轉移[19]。例如在乳腺癌細胞系中，敲除RIPK3或MLKL或用MLKL抑制劑Necrosulfonamide處理可顯著降低瘤細胞的致瘤性[20]。Strilic等[21]發現，小鼠和人肺癌細胞能誘導內皮細胞程序性壞死，促進腫瘤細胞外逃和轉移；當運用RIPK1抑制劑Nec- 1處理內皮細胞或敲除內皮細胞中的RIPK3的表達時，可以減少腫瘤細胞誘導的內皮細胞程序性壞死，降低腫瘤細胞外逃和轉移。研究表明，程序性壞死會募集免疫炎性細胞，從而促進血管生成及癌細胞增殖，加速腫瘤細胞轉移[2，22]。

鑒于程序性壞死在腫瘤發生發展過程中雙重作用，進一步研究程序性壞死發揮積極抗腫瘤效應的分子機制，可將程序性壞死抗腫瘤效應最大化。

誘導程序性壞死相關腫瘤治療藥物

近年來，研究發現許多化合物和藥物通過作用于RIPK1、RIPK3、MLKL等程序性壞死通路關鍵分子，誘導或抑制程序性壞死。本文重點介紹通過誘導程序性壞死而產生抗腫瘤作用的化合物與藥物。已報道能誘導程序性壞死的藥物如表1所示，根據其化學性質和作用機制等的不同可分為天然產物、化療藥物、死亡受體配體、激酶抑制劑、無機鹽、金屬配合物和金屬納米顆粒以及其他程序性壞死誘導劑。

表1 誘導程序性壞死的癌癥治療藥物

續表1

天然產物許多來源于植物、微生物或動物的天然產物能夠引起程序性壞死，顯示出抗癌活性。紫草素是從傳統中藥紫草中提取的萘醌類小分子化合物，研究發現它可以誘導P-糖蛋白、Bcl- 2或Bcl-xL高表達的MCF- 7和HEK293細胞程序性壞死，其特征為細胞器腫脹、質膜完整性喪失、線粒體膜電位下降[23]?？鄥A是從中草藥苦參中提取的一種生物堿，研究表明苦參堿處理的膽管癌細胞Mz-ChA- 1和QBC939細胞質膜破裂，細胞核完整，與壞死細胞的形態一致；進一步研究證實苦參堿可以通過促進RIPK1/RIPK3/MLKL復合物的形成而誘導程序性壞死[24]?？鄥A能夠上調RIPK3在Mz-CHA- 1細胞中的表達從而促進程序性壞死，為治療RIPK3低表達的膽管癌提供了可能[24]。大黃素是從中藥大黃中提取的一種蒽醌衍生物，體內外實驗表明大黃素可促進膠質瘤細胞及腫瘤組織中TNF-α、RIPK1、RIPK3和MLKL的表達，進而誘導細胞壞死而發揮抗腫瘤作用[25]。二氫歐山芹素是一種植物提取物。研究表明，小劑量二氫歐山芹素可以誘導結腸癌細胞HCT116凋亡；高劑量則會導致RIPK3上調并抑制Caspase- 8活性，從而促進HCT116細胞發生程序性壞死[26]。氧化石蒜堿是一種從小沙棘中提取的生物堿，對多種腫瘤細胞株均顯示出較強的殺傷活性；但其活性受Nec- 1抑制，氧化石蒜堿能夠上調白血病CCRF-CEM細胞中RIPK3的表達，表明其可以通過誘導程序性壞死而殺傷腫瘤細胞[27]。

星形孢菌素是一種從細菌中分離的生物堿，可誘導多種類型細胞的凋亡[28]。但當Caspase活化受損時，星形孢菌素可誘導白血病細胞中RIPK1和MLKL依賴性的程序性壞死[29]。天然產物neoalbaconol是一種從真菌中提取的小分子化合物，研究表明neoalbaconol通過促進RIPK1/RIPK3的共定位及相互作用而誘導腫瘤細胞程序性壞死，而Nec- 1能夠抑制neoalbaconol誘導的細胞死亡[30]。

蟾蜍毒配基是一種從蟾蜍毒素中提取的生物活性化合物，可通過RIPK3介導的途徑誘導程序性壞死，從而抑制結直腸癌的生長和轉移[31]。

化療藥物多種腫瘤化療藥物可通過誘導程序性壞死發揮抗腫瘤活性。依托泊苷是一種拓撲異構酶Ⅱ抑制劑，已被用于小細胞肺癌、淋巴瘤、睪丸癌等的治療[32]。依托泊苷可以抑制cIAP1和cIAP2表達，促進RIPK1的表達而誘導程序性壞死[33]。胸苷酸合成酶抑制藥5-氟尿嘧啶和糖原合酶激酶(GSK3α或GSK3β)抑制劑聯用可以克服p53缺陷型結腸癌細胞的凋亡耐受，誘導RIPK1依賴的程序性壞死，并在化療期間使耐藥的結腸癌細胞重新敏感[34- 35]。溴隱亭是治療垂體催乳素瘤最常用的多巴胺受體激動劑，能有效縮小催乳素瘤的腫瘤體積。研究發現，溴隱亭可通過磷酸甘油酸變位酶家族5/親環素D途徑誘導催乳素瘤細胞RIPK3/MLKL依賴性程序性壞死[36]。

死亡受體配體TRAIL是一種死亡受體配體，能夠誘導癌細胞凋亡，而對正常細胞的細胞毒性很小。但當細胞外環境呈酸性時，TRAIL可以誘導結腸癌HT29細胞和肝癌HepG2細胞發生程序性壞死而非凋亡。運用RIPK1及PARP- 1抑制劑或siRNA下調RIPK1及RIPK3的表達，均能夠抑制TRAIL誘導的程序性壞死及PARP- 1依賴性的胞內ATP耗竭，表明PARP- 1是RIPK1/RIPK3下游的活性效應分子[37]。胰腺癌細胞中，運用RIPK1抑制劑及siRNA下調RIPK3的表達能夠抑制TRAIL誘導的細胞死亡，表明TRAIL也可以誘導人胰腺癌細胞的程序性壞死[38]。

CD95配體(CD95L)，也稱為Fas配體，也是一種死亡受體配體，在與受體CD95結合后可誘導凋亡。Pietkiewicz等[39]研究表明，CD95L和吉西他濱的聯合可以同時誘導胰腺癌細胞的凋亡和程序性壞死。CD95L單獨使用時，主要誘導Caspase依賴性的細胞凋亡，這一死亡方式可被Caspase抑制劑zVAD-fmk完全抑制。但當CD95L與吉西他濱聯用時，zVAD-fmk及Nec-1均只能部分抑制細胞死亡。而zVAD-fmk與Nec-1聯用則能完全抑制細胞死亡，表明與吉西他濱聯用改變了CD95L誘導的細胞的死亡方式，吉西他濱顯著增強了CD95L誘導的RIPK1介導的程序性壞死。

激酶抑制劑已發現程序性壞死與多種激酶抑制劑的抗腫瘤作用有關。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，主要作用于MAPK通路。研究表明，當Caspase活性被抑制時，索拉非尼能通過程序性壞死誘導多發性骨髓瘤細胞死亡[40]，這一過程可被Nec- 1抑制。索拉菲尼還可以誘導霍奇金淋巴瘤細胞RIPK1依賴性的程序性壞死[41]。據報道，烷化劑3-溴丙酮酸(3-BrPA)通過抑制糖酵解的關鍵酶之一，己糖激酶Ⅱ的活性誘導細胞死亡[42]。MLKL抑制劑NSA可以逆轉3-BrPA誘導的膀胱癌細胞株T24死亡，RIPK1抑制劑Nec- 1處理并不能挽救3-BrPA誘導的細胞死亡，這表明3-BrPA通過非依賴RIPK1但依賴RIPK3/MLKL的途徑誘導細胞死亡[43]。CCT137690是一種極光激酶A抑制劑，可通過抑制極光激酶A的活性而促進RIPK3與RIPK1形成壞死復合物，進而誘導程序性壞死，CCT137690在體外和體內都能顯著抑制胰腺癌的生長[44]。BI2536是一種有絲分裂激酶Plk1的小分子抑制劑，抑制Plk1的活性可誘導前列腺癌LNCaP-AI細胞Caspase非依賴性的死亡，這一過程可被Nec- 1抑制，表明BI2536可誘導前列腺癌細胞程序性壞死[45]。

無機鹽、金屬配合物和金屬納米顆粒氯化鈷(CoCl2)能夠誘導細胞缺氧誘導因子- 1α(hypoxia inducible factor- 1，HIF1α)的表達，因此常用于體外缺氧模型的構建[46]。研究表明氯化鈷可誘導結腸癌細胞HT- 29凋亡。但當氯化鈷與zVAD-fmk聯用時，則可增加RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的表達，從而誘導程序性壞死[47]。大量研究表明金屬鋰具有潛在的抗腫瘤作用。氯化鋰(LiCl)可通過激活AKT/mTOR通路誘導神經鞘瘤細胞程序性壞死，程序性壞死抑制劑Nec- 1、ROS抑制劑NAC及AKT/mTOR通路抑制劑均可逆轉上述作用，Nec- 1可抑制AKT/mTOR通路的激活，提示AKT/mTOR通路位于RIPK1的下游[48]。

錸[Re(Ⅳ) ]配合物體外實驗顯示對乳腺、卵巢和前列腺癌細胞具有很強的抗增殖活性[49]。錸氧配合物處理結直腸癌細胞后，熒光顯微鏡觀察到細胞膜破裂、線粒體損傷、碘化丙啶攝取和ROS產生增加等程序性壞死特征，且受RIPK1及RIPK3的調控[50]。順鉑是一種具有抗癌活性的金屬配合物，主要用于卵巢癌、前列腺癌、食管癌等的治療[51]。研究表明，在凋亡耐受的食管癌細胞中，順鉑可以通過自分泌TNF-α信號誘導壞死復合物的形成，引起食管癌細胞RIPK3依賴性的程序性壞死，抑制食管癌細胞生長[52]。

納米銀顆粒(AgNPs)是已知可以誘導癌細胞凋亡的金屬納米顆粒。Zielinska等[53]研究發現，AgNPs可以誘導胰腺癌PANC- 1細胞程序性壞死和凋亡，誘導腫瘤抑制因子p53蛋白、程序性壞死相關蛋白RIPK- 1、RIPK- 3、MLKL和自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的水平上調。硒納米顆粒(SeNPs)在前列腺癌細胞系PC- 3中誘導ROS介導的程序性壞死，促進RIPK1的表達，但PC- 3細胞中RIPK3表達較低且SeNPs并未誘導MLKL磷酸化水平的提升，表明SeNPs通過非經典途徑誘導細胞程序性壞死[54]。

其他程序性壞死誘導劑Caspases第二線粒體激活因子(Smac)是一種內源性蛋白質，可以通過抑制cIAP來促進細胞凋亡。Smac類似物是Smac的小分子模擬物，是一類新型抗癌藥物[55]。Birinapant(TL32711)是一種二價Smac類似物，可在患者來源的急性淋巴細胞白血病細胞中誘導RIPK1依賴的凋亡和程序性壞死，并在小鼠體內顯示出抗腫瘤作用[56]。Hannes等[57]報道，另一種Smac類似物(BV6)與TNF-α聯合應用，可通過誘導RIPK1/RIPK3復合物的形成來誘導胰腺癌細胞發生程序性壞死并阻斷細胞凋亡。在急性髓系白血病中，BV6可拮抗凋亡抑制蛋白的過表達，并觸發TNF-α依賴的程序性壞死，從而殺死腫瘤細胞[58]。這些研究表明可以開發Smac類似物作為促進程序性壞死的新型化療藥物，從而克服凋亡耐受。

泛素-蛋白酶體系統是細胞選擇性降解不需要或受損蛋白質的重要途徑，在調控細胞周期和細胞死亡過程中起著重要作用[59]。蛋白酶體抑制劑在臨床上被認為是一種很有前途的抗癌藥物，經典的蛋白酶體抑制劑硼替佐米已用于治療多發性骨髓瘤[60]。Moriwaki等[61]報道蛋白酶體抑制劑MG132和硼替佐米能激活小鼠成纖維細胞和人類白血病細胞中RIPK3/MLKL依賴性程序性壞死。不同于經典TNF樣細胞因子誘導的壞死，蛋白酶體抑制劑誘導的壞死不需要Caspase活性的抑制，但依賴于RIPK3上完整的RIP同型相互作用基序(RHIM)。研究發現，硼替佐米和Toll樣受體激動劑聯合使用可激活RIPK3壞死性途徑，z-VAD-fmk或MLKL抑制劑NSA處理可分別減少硼替佐米介導的白血病細胞THP-1死亡，說明硼替佐米可同時誘導細胞的凋亡和程序性壞死[62]。由此可見，泛素-蛋白酶體系統可能是依賴RIPK3的程序性壞死的潛在調控途徑，蛋白酶體抑制劑可用作靶向程序性壞死途徑的抗癌藥物。

Obatoclax是一種抗凋亡蛋白Bcl- 2的小分子抑制劑，可通過誘導自噬而觸發程序性壞死，這一發現將自噬與程序性壞死聯系在一起[63]。聚肌胞苷酸(PolyIC)是一種病毒dsRNA類似物，在宮頸癌細胞中可以誘導程序性壞死，壞死的細胞會產生IL- 1α，從而激活樹突細胞釋放IL- 12，這一過程對于對抗腫瘤活性至關重要[64]。NUPRI1是固有無序蛋白的一員，能促進胰腺癌的發展，因此成為抗癌治療靶點[65]。據報道，一種新合成的NUPR1抑制劑ZZW- 115通過引起線粒體功能障礙誘導程序性壞死，抑制小鼠體內胰腺移植瘤的生長[66]。雙酚A是一種具有雌激素活性的化學物質[67]，能誘導人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y發生凋亡，繼而出現壞死。當Nec- 1與雙酚A聯用時，程序性壞死被細胞凋亡所取代，表明雙酚A能部分誘導程序性壞死[68]。

總結與展望

程序性壞死是一種受調控的細胞死亡形式，這為藥物干預這一過程提供了可能。一系列的研究表明，程序性壞死在腫瘤發生、發展及轉移過程中發揮重要作用。目前已發現大量的化合物和藥物可通過直接或間接作用于RIPK1、RIPK3及MLKL等關鍵分子調控細胞程序性壞死的發生。特別是對于腫瘤細胞凋亡耐受的情況，誘導程序性壞死的藥物可以使細胞對死亡重新敏感，這為克服耐藥提供了一種有效方法。雖然通過藥物誘導程序性壞死具有一定的抗腫瘤效應，但研究也發現程序性壞死具有促進某些腫瘤發生和轉移的作用。因此，對于誘導程序性壞死可能帶來的不良反應也需要格外關注。綜上，深入了解程序性壞死的作用機制及其對癌癥進程的影響，探究程序性壞死誘導劑的適應證人群，將進一步拓展這類藥物在抗腫瘤領域的應用。