防風通圣丸改善多囊卵巢綜合征大鼠胰島素抵抗的作用研究

韓方，張熒，蒯顧平，任青玲，胡榮魁*

(1.南京中醫藥大學附屬醫院,江蘇 南京 210029；2.南京中醫藥大學醫學院·整合醫學學院,江蘇 南京 210023)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種育齡女性常見的異質性生殖內分泌綜合征，其在育齡女性中的發病率約為6%～19%[1]。PCOS以慢性無排卵(排卵功能紊亂或喪失)、高雄激素血癥和多囊卵巢為典型特征。PCOS患者常易發展為代謝綜合征，具體表現為胰島素抵抗、高胰島素血癥、腹型肥胖、高脂血癥[1-2]。研究發現胰島素抵抗在PCOS患者中的發病率高達70%，是導致PCOS生殖、代謝異常的關鍵因素之[2-3]。

PCOS多歸屬于中醫學“月經失調”“閉經”“崩漏”“不孕”等疾病的范疇?！杜魄幸吩唬骸胺拾讒D人，經閉而不通者，必是痰濕與脂膜壅塞之故也?！比f全在《萬氏婦人科》中提出：“惟彼肥碩者，膏脂充滿，元室之戶不開，挾痰者痰涎壅滯，血海之波不流，故有過期而經始行，或數月經一行，及為濁，為帶，為經閉，為無子之病?！敝煺鸷嘣凇兜は姆ā分杏涊d：“若是肥盛婦人，稟受甚厚，恣于酒食之人，經水不調，不能成胎，謂之軀脂滿溢，閉塞子宮，宜行濕燥痰?！笨梢姽糯t家認為PCOS多與痰濕有關。臨床橫斷面研究顯示，痰濕體質者較非痰濕體質者血糖、胰島素水平更高，更易出現胰島素抵抗[4]。胰島素抵抗導致的糖、脂代謝障礙又被證實是痰濕的現代生物學基礎之一，因而胰島素抵抗被認為是痰濕形成的病理生理基礎[4-5]。

國醫大師夏桂成教授通過對多囊卵巢綜合征分型的長期研究，發現痰濕肥胖型多囊卵巢綜合征存在陰虛及陽者較多，這是因為本病長期處于經后期的狀態，陰虛陽弱甚至有陰無陽，陰虛則精卵不能成熟，不能順利陽長，陰不足則陽長欠盛，陽虛易致水濕內停，釀生痰濕，進而凝結為痰脂，導致肥胖。同時，陰陽轉化不利，氣血津液不能和暢，也易于釀生痰濕、甚至留瘀，從而導致多囊卵巢綜合征復雜的病理過程和多樣的病理產物。夏桂成教授主張治療痰濕閉經應從減肥、通經、調周期方面入手, 認為痰濁脂肪蘊塞，大便秘結之肥胖，當給予防風通圣丸治療，以達到表里雙解、通腑泄熱的目的[6]。本研究采用來曲唑構建胰島素抵抗型PCOS大鼠模型，觀察防風通圣丸對胰島素抵抗型PCOS大鼠的療效并探查其可能的作用機理，為臨床使用防風通圣丸治療胰島素抵抗型PCOS提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雌性21日齡SD大鼠20只，體質量150～180 g，動物許可證號：SCXK(浙)2019-0002，購自浙江省醫學科學院。動物入室后常規飼養于屏障環境，自由飲水，12 h交替照明，室溫(22±3)℃，相對濕度40%～70%。

1.1.2 實驗藥物

來曲唑(美國諾華制藥公司)；防風通圣丸(北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠)，藥物組成：防風、荊芥穗、薄荷、麻黃、大黃、芒硝、梔子、滑石、桔梗、石膏、川芎、當歸、白芍、黃芩、連翹、甘草、白術(炒)。

1.1.3 主要實驗試劑與儀器

羧甲基纖維素(Sigma公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術公司)；蘇木素、伊紅染色液、游離自由脂肪酸檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；雌二醇、睪酮ELISA 檢測試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)；胰島素ELISA 檢測試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)；V型膠原酶(Sigma公司)；胰島素受體β(anti-Insulin Receptor β，IRβ)抗體(SANTA CRUZ生物科技公司)；抗小鼠抗體(南京潤研生物科技有限公司)。Z326K型高速冷凍離心機(德國Hermle公司)；RM2235型切片機(上海徠卡儀器有限公司)；TEC-5-EMJ-2型石蠟包埋機(日本櫻花檢驗儀器株式會社)；1708265型ChemiDocXPS+化學發光成像系統，1703930型濕轉印槽，1658001型小垂直板電泳槽(美國Bio-Rad公司)；1510型全波長酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物建模

21日齡雌性SD大鼠適應性喂養3 d后，隨機分為正常對照組(6只)和模型組(14只)。模型組將芳香化酶抑制劑來曲唑(1.0 mg/kg)溶于1%羧甲基纖維素(2 mg/kg)中，每日灌胃，連續21 d，正常對照組則每日給予等量的0.5%羧甲基纖維素，連續21 d，于造模第12天開始每日陰道涂片，觀察各組大鼠動情周期變化，連續10 d，成功誘導PCOS大鼠13只。

1.2.2 分組、給藥

13只PCOS大鼠隨機分為模型組(6只)、防風通圣丸組(7只)。防風通圣丸組按照人鼠體質量比的1倍計算每日灌胃給藥劑量，連續14 d；正常對照組、模型組則每日灌服水，連續14 d。

1.2.3 血清激素水平測定

實驗干預結束后，于干預末日20∶00開始禁食，次日8∶00腹腔注射10%水合氯醛麻醉，抽取腹主動脈血5 mL，離心血液標本，取血清，按照試劑盒說明操作，ELISA法測定血清雌二醇、睪酮濃度。

1.2.4 血清糖、脂代謝指標測定

全自動生化分析儀檢測血糖、血脂(包括膽固醇、甘油三酯)濃度；微量法測定血清游離脂肪酸濃度；ELISA法測定血清胰島素濃度；計算胰島素抵抗(HOMA-IR)指數，HOMA-IR =空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mIU/L)/22.5。

1.2.5 卵巢組織病理形態檢測

留取右側卵巢組織，置于4%福爾馬林固定，蠟塊包埋，HE染色，顯微鏡觀察卵巢組織的病理學形態。

1.2.6 葡萄糖刺激胰島素分泌實驗

摘取胰腺，剪刀切碎胰腺，將胰腺置于0.5% V型膠原酶溶液中，37 ℃恒溫水浴中消化15 min, 10%胎牛血清終止消化，250×g4 ℃離心1 min，重復2次，顯微鏡下，挑出胰島。參照文獻[7-8]，將胰島在37 ℃和5% CO2的標準Krebs-Ringer碳酸氫鹽(KRB)溶液中預孵育1 h，然后在補充有3.3 mmol/L葡萄糖的KRB中洗滌、孵育1 h，隨后用含有16.7 mmol/L葡萄糖的KRB中孵育1 h。每次處理后收集上清液，ELISA法測定上清胰島素濃度。

1.2.7 Western blotting測定骨骼肌(比目魚肌)IRβ蛋白水平

按照蛋白裂解液提取試劑盒說明書要求提取各組比目魚肌總蛋白，按比例加入裂解液后置于勻漿機研磨，隨后置碎冰上裂解1 h，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書檢測各組蛋白濃度。取各組30 μg蛋白上樣，電泳，濃縮膠電壓70 V，分離膠90 V。轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗稀釋液(抗IRβ1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加入二抗稀釋液(1∶3 000)室溫孵育1 h，ECL發光顯色，曝光。使用Image J圖像分析軟件進行分析灰度值。

1.2.8 統計學方法

采用SPSS Statistics 20.0軟件處理，所有計量資料以均數±標準誤表示，進行單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Student-Newman-Kueuls檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量、性腺旁脂肪組織重量檢測

實驗結束后，模型組大鼠體質量、性腺旁脂肪重量顯著高于正常對照組(P<0.05)；防風通圣丸組體質量、性腺旁脂肪重量顯著低于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠實驗結束體質量、性腺旁脂肪組織重量比較

2.2 血清性激素水平檢測

模型組血清雌二醇水平較正常對照組顯著降低(P<0.05)，防風通圣丸組血清雌二醇水平較模型組顯著升高(P<0.05)；模型組血清睪酮水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，防風通圣丸組血清睪酮水平較模型組顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.3 卵巢組織形態學觀察

光鏡下正常對照組見黃體和處于不同發育階段的卵泡，卵泡顆粒細胞約9～16層，排列整齊、緊密，卵泡內見放射冠以及卵母細胞(圖1A)；模型組見黃體和多個囊性擴張的卵泡，卵泡體積增大，卵泡中卵母細胞或放射冠消失，顆粒細胞極薄約2～4層，排列疏松(圖1B)；防風通圣丸組黃體及處于不同發育階段的卵泡數量介于正常對照組和模型組之間, 部分卵泡內可見卵母細胞、放射冠，顆粒細胞增厚約為8～10層，排列較緊密(圖1C)。

圖1 卵巢組織學圖片( HE，×400)

2.4 糖代謝、脂代謝水平檢測

模型組空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR指數、膽固醇、甘油三酯、自由脂肪酸較正常對照組顯著升高(P<0.05)，防風通圣丸組空腹血糖水平、空腹胰島素水平、HOMA-IR指數、膽固醇、甘油三酯、自由脂肪酸較模型組顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠糖代謝與脂代謝水平比較

2.5 葡萄糖刺激胰島分泌胰島素實驗

模型組3.3 mmol/L葡萄糖、16.7 mmol/L葡萄糖刺激胰島分泌胰島素較正常對照組顯著升高(P<0.05)，防風通圣丸組3.3 mmol/L葡萄糖、16.7 mmol/L葡萄糖刺激胰島分泌胰島素PCOS 模型組顯著降低(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠葡萄糖刺激胰島分泌胰島素比較

2.6 骨骼肌(比目魚肌)IRβ蛋白水平

模型組比目魚肌IRβ蛋白水平較正常對照組顯著降低(P<0.05)，防風通圣丸組比目魚肌IRβ蛋白水平較模型組顯著上調(P<0.05)，見圖2。

注：A.蛋白條帶圖；B.蛋白相對表達量圖。C.正常對照組；M.模型組；F.防風通圣丸組。與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖2 各組大鼠比目魚肌IR-蛋白條帶圖及水平比較

3 討論

防風通圣丸是金元四大家之一劉完素創立的名方，出自《黃帝素問·宣明論方》，由防風、荊芥、薄荷、麻黃、大黃、芒硝、梔子、滑石、桔梗、石膏、川芎、當歸、白芍、黃芩、連翹、甘草、白術共17 味中藥組成。本方集汗下清補于一方, 分消表里邪熱, 兼顧氣血, 驅邪而不傷正，具有通里解表、清熱解毒的功效。

本實驗研究結果顯示，經防風通圣丸治療的胰島素抵抗型PCOS大鼠，胰島素抵抗明顯改善，空腹血糖、胰島素水平及HOMA-IR指數顯著降低。外周靶組織的胰島素作用受損(即外周胰島素抵抗) 、胰島素分泌缺陷是導致胰島素抵抗的機制。骨骼肌是影響機體糖代謝的主要器官之一，其承擔了機體85%由胰島素刺激引起的葡萄糖轉運[9]。因此，骨骼肌作為胰島素作用的主要靶器官，在胰島素抵抗的病理生理過程中發揮著重要作用。骨骼肌中IR-β是葡萄糖的主要利用者，在維持機體葡萄糖水平中起關鍵作用。胰島素受體為酪氨酸蛋白激酶型受體，由IR-α和IR-β亞單位組成，胰島素與IR-α結合后，引起IR-β的酪氨酸磷酸化，并在胰島素受體底物的參與下，激活磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，活化的PI3K在骨骼肌細胞中促進葡萄糖轉運蛋白4移位到細胞膜上，促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取[10]。研究顯示肥胖、Ⅱ型糖尿病患者骨骼肌IR-β蛋白水平降低[10-11]。MISHRA等[8]研究顯示二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)誘導的胰島素抵抗型PCOS大鼠骨骼肌IR-β蛋白水平降低。本研究顯示，PCOS模型大鼠比目魚肌IR-β蛋白水平降低，經防風通圣丸治療后目魚肌IR-β蛋白水平上調。此外，本研究顯示模型組分離的胰島表現出葡萄糖刺激的胰島素分泌較正常大鼠的胰島增加，表明來自模型組的胰島產生更高水平的胰島素。而從防風通圣丸組分離的胰島表現出葡萄糖刺激的胰島素分泌較模型組分離的胰島降低，表明來自防風通圣丸組的胰島分泌胰島素缺陷改善。

胰島素抵抗是導致PCOS患者生殖、代謝異常發病機制的核心組成部分。胰島素通過胰島素樣生長因子-1受體介導，刺激卵巢產生雄激素，雄激素升高阻礙卵泡發育并誘導其在成熟前閉鎖，維持持續無排卵狀態，卵巢內升高的雄激素抑制芳香化酶活性，阻礙雌激素生成。血清高胰島素血癥還可通過減少肝臟SHBG的合成，導致游離睪酮含量增加，從而導致PCOS的高雄激素血癥。高雄激素血癥導致脂肪細胞功能失調，進一步影響糖、脂質代謝和卵泡生長發育。胰島素通過抑制脂肪組織釋放自由脂肪酸調節脂質氧化代謝，胰島素抵抗患者的這種抑制作用被打破，導致血液中自由脂肪酸增多，流經肝臟的自由脂肪酸增多，加速甘油三酯合成[12-13]。本研究顯示防風通圣丸可明顯降低胰島素抵抗型PCOS大鼠的睪酮水平，提升PCOS大鼠雌二醇水平，并改善PCOS大鼠脂代謝及卵泡生長發育。

綜上所述，防風通圣丸能夠改善胰島素抵抗型PCOS模型大鼠糖、脂代謝異常，調控機體性激素水平，起到治療PCOS生殖、代謝異常作用，其改善PCOS胰島素抵抗分子機制為提高骨骼肌IR-β蛋白水平、降低葡萄糖刺激胰島分泌胰島素。