“虛煩不得眠”證候的闡釋：大鼠狀態性焦慮及其睡眠時相變化

楊悅，王艷艷，卞宏生，于爽，李廷利，黃莉莉

(黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

黃莉莉(1978-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事中藥生物活性及機制研究。

“虛煩不得眠”是酸棗仁湯主治證候?，F代有關酸棗仁湯的藥理研究或單獨開展拮抗焦慮作用的研究，或單獨開展改善睡眠研究，這種研究模式難以闡明酸棗仁湯的藥理作用本質。在當前藥理研究中焦慮動物模型和失眠動物模型都是單獨復制，利用現有模型不能整體反映出“虛煩不得眠”的證候?；谶@種現狀，復制“虛煩不得眠”的動物模型是全面闡明酸棗仁湯作用實質的關鍵。因此我們利用條件性恐懼來復制動物的焦慮模型，并利用皮層腦電描記與分析技術分析其睡眠障礙的類型，以此來復制“虛煩不得眠”的動物模型，為今后酸棗仁湯的中藥藥理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體質量(220±20)g，SPF級，購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(黑)2018-007。飼養于標準獨立通氣籠IVC，自動定時光控系統實行12 h光照/12 h黑暗交替處理(7∶00 am開燈/7∶00 pm熄燈)，恒溫恒濕條件,濕度(50%±10%)，溫度(23±1)℃。4只/籠，可自由獲取食水。

1.2 主要儀器和設備

RU25H5型獨立通氣籠IVC，蘇州市蘇杭科技器材有限公司；XR-XC404型SuperFcs條件性恐懼實驗分析系統，上海欣軟信息科技有限公司；XR-XG201型大鼠高架十字迷宮裝置(EPM)，上海欣軟信息科技有限公司；MP-150型十六通道生理記錄儀，美國Biopac公司；51600大鼠腦立體定位儀，美國Biopac公司。

1.3 方法

1.3.1 分組與動物模型的復制

1.3.1.1 大鼠皮層腦電與肌電電極的埋置

4%水合氯醛將大鼠麻醉后，固定于腦立體定位儀，碘酒消毒頭部創口并剔除毛發，剪去頭部皮膚，酸蝕劑去除組織筋膜，鹽水清潔使充分暴露顱骨，待顱骨干潔時于前囟前1 mm，額骨中線旁開1.5 mm；人字縫前1 mm，頂骨中線旁開1.5 mm埋置2根皮層腦電電極，頸部肌肉埋置肌電電極，牙托粉固定后恢復1周，期間自由攝入食水。

1.3.1.2 條件性恐懼所致大鼠狀態性焦慮模型的復制

SD雄性大鼠隨機分為對照組和模型組，每組8只，IVC系統適應性飼養7 d，條件性恐懼刺激的前3天開始，每天同一操作人員撫摸大鼠 2～3 min，持續3 d，使大鼠習慣實驗人員。實驗于12∶00—18∶00進行。第8天開始實驗。在條件性恐懼刺激前30 min，將實驗動物分單籠放置于條件性刺激裝置所在環境中適應。每次抓取一只大鼠輕撫鼠背后提取鼠尾托住大鼠，使頭部正對箱門放入。刺激箱中適應3 min后開始條件性刺激。模型復制方法采取5 s噪聲(1 000 Hz，75 dB)，第5 s持續1 s足底電擊共同終止的刺激方案(0.5 mA)，該事件循環發生15次，每次間隔1 min；對照組則只施加5 s噪聲而無電擊(1 000 Hz，75 dB)，其他實驗要求與模型組相同，循環15次，每次間隔1 min。每只動物實驗結束后于刺激箱中適應3 min再放回原單籠，送回飼養室,并用10%的酒精擦除箱中的動物排泄物及殘留氣味。連續進行4 d模型復制。

僵直反應(Freezing)指標的判斷：模型復制后翌日，將大鼠置于條件性刺激箱，適應3 min后，記錄5 min內每次聲信號后大鼠頭、軀體、四肢均不動的行為時間。

1.3.2 高架十字迷宮實驗方法與觀測指標的判斷

測試于12∶00開始。在行為學測試前30 min，待測動物分單籠放置于EPM所在安靜環境中適應。實驗開始時，將實驗動物置于EPM中央平臺區，面向一側開放臂釋放同時開始計時，每只動物自由探索5 min，通過錄像采集行為指標，每次測試結束后將動物放回原籠送回飼養室，并用10%的酒精徹底清潔，去除動物排泄物和氣味。指標的生物學意義與判斷方法如下[1-3]。

開放臂運動時間(Time in open arms)：直觀反映動物對高懸敞開環境的厭惡程度(四肢完全進去任意開放臂的停留時間，直至四肢完全脫離開放臂)；

封閉臂運動時間(Time in closed arms)：直觀反映動物對相對封閉環境的偏好(四肢完全進去任意封閉臂的停留時間，直至四肢完全脫離封閉臂)；

開放臂進入次數(Open arm entries)：體現對新奇環境的探究性(四只爪完全進去任意開放臂的頻次，只兩前肢進入記為探究開臂)；

總入臂次數(Total arm entries)：總入臂次數可體現動物的運動活性，在無其他外因干擾下，次數減少反映為焦慮水平增加(四只爪完全進去任意開放臂和封閉臂頻次之和)；

1.3.3 條件性恐懼所致大鼠狀態性焦慮持續時間及其睡眠-覺醒周期變化的研究

在上述實驗條件下，實驗動物經歷連續4 d的條件性刺激。模型復制后的翌日開始首次條件性刺激后的EPM行為學測試(第1天)。所有實驗動物分別于條件性刺激后第1、7、10、14、21天進行EPM中的行為學評價，錄像記錄相關行為參數。每日測試完成后連接十六通道生理記錄儀，連續描記24 h的腦電圖。

1.4 統計學處理方法

本研究應用IBM SPSS Statistics 24軟件進行統計分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；連續檢測數據采用重復測量方差分析，非正態性數據采用Mann-WhitneyU非參數檢驗，計量資料以均數±標準差或中位數(四分位距)統計描述。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠僵直反應時間的變化

結果顯示，與對照組相比，造模后大鼠僵直反應時間顯著增加(P<0.01)，見表1。

表1 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠僵直反應時間的變化

2.2 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠EPM中的行為學變化

2.2.1 開放臂運動時間、封閉臂運動時間、開放臂進入次數及總入臂次數的變化

與對照組相比，不同測試天數下的模型組大鼠開放臂運動時間于第1、7和10天顯著縮短(P<0.05)、開放臂進入次數于第1、7、10、14天顯著降低(P<0.05)，總入臂次數于第1、7、10和21天顯著減少，封閉臂運動時間略有延長而未見明顯變化，見圖1。

注：與同期對照組比較，*P<0.05。圖1 條件性恐懼大鼠EPM中開放臂運動時間、封閉臂運動時間、開放臂進入次數及總入臂次數的變化

2.2.2 進入開放臂時間與次數比例的變化

與對照組相比，不同測試天數下的模型組大鼠開放臂進入次數比例和運動時間比例均降低，其中第1 、7、10、14天呈顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

注：與同期對照組比較，*P<0.05。圖2 條件性恐懼大鼠EPM中開臂時間比例及次數比例的變化

2.3 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠覺醒-睡眠時間和睡眠時相的變化

2.3.1 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠覺醒-睡眠時間的變化

2.3.1.1 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第1、7、10、14、21天Wake時間的變化

與對照組相比，不同測試天數下狀態性焦慮大鼠的Wake時間明顯延長(P<0.01，P<0.05)，其中第1、7、10、14天大鼠Wake時間的變化更加明顯，結果見表2～表6。

表2 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第1天Wake時間變化

表3 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第7天Wake時間變化

表4 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第10天Wake時間變化

表5 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第14天Wake時間的變化

表6 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第21天Wake時間變化

2.3.1.2 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第1、7、10、14、21天NREMS時間的變化

與對照組相比，不同測試天數下狀態性焦慮大鼠的NREMS時間明顯縮短(P<0.01，P<0.05)，其中第1、7、10、14天大鼠NREMS時間的變化更加明顯，見表7～表11。

表7 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第1天NREM睡眠時間變化

表8 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第7天NREM睡眠時間變化

表9 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第10天NREM睡眠時間變化

表10 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第14天NREM睡眠時間變化

表11 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第21天NREM睡眠時間變化

2.3.1.3 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第1、7、10、14、21天REMS時間變化

與對照組相比，不同測試天數下狀態性焦慮大鼠REM睡眠時間明顯增加(P<0.01，P<0.05)，其中第1、7、10、14天大鼠REMS時間的變化更加明顯，見表12～表16。

表12 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第1天REM睡眠時間變化

表13 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第7天REM睡眠時間變化

表14 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第10天REM睡眠時間變化

表15 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第14天REM睡眠時間變化

表16 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠第21天REM睡眠時間變化

2.3.2 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠覺醒-睡眠時相比例的變化

與對照組相比，不同測試天數下狀態性焦慮大鼠的Wake時間比例于第7、10、14天明顯增加(P<0.01，P<0.05)，伴有NREMS時間比例第1、7、10、14天的明顯減少(P<0.01，P<0.05)和REMS時間比例第1天的明顯增加(P<0.05)，見表17。

表17 條件性恐懼所致狀態性焦慮大鼠覺醒-睡眠時相比例的變化

3 討論

酸棗仁湯出自漢·張仲景《金匱要略》，主治“虛勞，虛煩不得眠”。通過原著的溫習及參考相關文獻，我們認為“虛勞，虛煩不得眠”的內涵是“虛勞”，是“虛煩不得眠”病因病機之所在，而“虛煩不得眠”是“虛勞”的證候之一,這一推斷可從《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治六》分析得出?！把蕴搫诓∶}證并治六”篇中涉及脈證九條及方九首，通過對“脈證九條及方九首”進行分析，“方九首”所治之病均為“血痹或虛勞病”，但不同的方主治證候各有不同，酸棗仁湯主治證候是“虛煩不得眠”，而且酸棗仁湯主治的“虛煩不得眠”之證候是一個整體不可分割。但是縱觀現代開展的有關酸棗仁湯的中藥藥理研究，不是基于其“虛煩”之癥單獨開展拮抗焦慮作用的研究，就是基于其“不得眠”之癥單獨開展改善睡眠作用的研究，這種研究范式，難以闡明酸棗仁湯的藥理作用本質。我們認為要想闡明酸棗仁湯的藥理作用本質就必須圍繞酸棗仁湯主治“虛煩不得眠”這一特殊證候來開展?；诖?，復制“虛煩不得眠”這一動物模型就成為了闡明酸棗仁湯的藥理作用本質的關鍵之所在。

在藥理研究中焦慮與失眠動物模型是分別復制的，故不能反映“虛煩不得眠”這一證候，而且無論是焦慮還是失眠動物模型的復制都各自存在許多不同的復制方法。我們基于酸棗仁湯所治“虛煩不得眠”之證候由肝血不足，陰虛內熱而起。肝藏血，血舍魂，若肝血不足，魂不守舍，心失所養，則虛煩不眠，心悸不安；血虧陰虛，易生內熱，虛熱內擾，虛煩不安?！夺t學正傳》指出:“恐通腎，驚通心肝”。驚恐太過則可導致肝血不足，魂不守舍，心失所養，則虛煩不眠的認知，利用條件性恐懼復制大鼠狀態性焦慮模型，并利用皮層腦電描記與分析技術，來復制“虛煩不得眠”證候的模型，為今后闡明酸棗仁湯的藥理作用本質奠定基礎。

在當前中醫情志病證的實驗研究中多用行為學方法來判定[4-5]，其中焦慮動物模型大多借用國際上經典的動物模型，包括高架十字迷宮、天敵暴露、孤養等非條件化模型，以及Geller-Seifter和Vogel飲水沖突實驗、防御性掩埋等條件化模型，條件性恐懼所致焦慮模型可作為焦慮動物模型的一種。DAVIS[6]發現經歷條件性恐懼訓練動物的行為表現，與臨床焦慮癥患者的表征是相似的。其理論基礎是條件性刺激引發動物對已知但又不可預期事件的恐懼和焦慮，可模仿人類生理反應的行為表型(僵直或回避)，且苯二氮類、巴比妥類、阿片類、SSRI等均已表現出對條件性恐懼模型的抗焦慮活性。

動物模型的效果為暫時性的生理改變，隨時間推移造模效果趨于消散，明確焦慮動物模型的持續時間，以便更合理應用于實驗研究，對焦慮發病機制和有關藥物評價研究具重要意義。就目前21 d行為學測試周期的研究結果可知，條件性恐懼可增加大鼠對厭惡環境的恐懼程度和對安全區域的偏好，并伴有運動性水平的降低，整體行為呈現明顯的探究性抑制，模型效果隨時間延長逐漸消退[7-8]，前14天更顯著的焦慮行為指標提示14 d內更明顯的焦慮水平。以往條件性恐懼模型多在訓練后短期內爭取模型效果消退前的藥效評價[9-10]。雖然中藥在治療焦慮上有很好的療效，且與化學合成藥相比，中醫藥治療具有個體化用藥、治療多靶點多途徑的優勢[11-13]，但存在起效慢、給藥周期長的特點，明確條件性恐懼誘導大鼠狀態性焦慮模型的持續時間,為今后中藥藥效治療而非預防作用的評價提供方法學借鑒。

睡眠障礙常作為廣泛性焦慮癥的一項癥狀學診斷標準，而睡眠又是多項指標代表的復雜過程，腦電圖是睡眠測量的客觀手段，焦慮癥患者的睡眠問題體現在入睡潛伏期延長，總睡眠時間和睡眠深度降低，睡眠連續性不佳等[14]。中醫在探討情志學說時常出現“不寐”“不得眠”的證候，如《類證治裁·不寐》曰：“思慮傷脾,脾血虧損,經年不寐”；《景岳全書·不寐》談到：“無邪而不寐者,必營氣不足也,營主血,血虛則無以養心,心虛則神不守舍”；《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治第六》篇指出：“虛勞虛煩不得眠，酸棗湯主之”；《傷寒論·辨太陽病脈證并治》第76條提到：“發汗吐下后,虛煩不得眠，若劇者，必反復顛倒，心中懊惱,梔子豉湯主之”等。表明了情志不遂，勞動思慮太過誘發失眠的病因，說明焦慮癥與虛勞不寐之間一定的相關性[15-16]。本研究在狀態性焦慮模型復制基礎上進行睡眠監測，發現狀態性焦慮大鼠伴有以高覺醒和NREMS減少為主要特征的睡眠-覺醒周期變化，REMS于模型后第1天有明顯增加，后期略有減少。相關報道指出，NREMS在抵御焦慮癥的發展中扮重要角色，NREMS紡錘波和κ復合波階段是記憶鞏固的關鍵過程，慢波睡眠階段具焦慮緩和作用，而高度焦慮個體表現為NREMS百分比降低[17]。REMS在情境記憶鞏固中起關鍵作用，REMS壓力包括更短的REM潛伏期，更多的REM密度和REM睡眠持續時間，但有關REMS的探討缺乏一致性，不同的睡眠深度和REM改變可能反映不同的癥狀[18]。明確條件性恐懼所致狀態性焦慮對睡眠-覺醒周期的影響，為闡明“虛煩不得眠”證候的科學實質提供實驗依據，為今后開展中醫焦慮性失眠的相關研究增設了平臺基礎。

綜上所述，本研究通過條件性恐懼方法誘導大鼠的狀態性焦慮模型，并觀察其睡眠時相的變化，“虛煩不得眠”證候主要表現為狀態性焦慮并發的睡眠時相障礙性改變。在探討中醫焦慮性失眠研究中，可作為中藥治療而非預防作用的評價手段。