黃芪多糖對放射性皮炎小鼠炎性因子和生長因子的影響

張國榮，張亞奇，尉志民，張建萍，周燕*

(1.蘭州大學第一醫院，甘肅 蘭州 730000；2.天水市第二人民醫院，甘肅 天水 741020)

放療是癌癥治療的重要手段之一，但高達95%的放療患者可發生放射性皮炎的并發癥，其癥狀多以瘙癢、疼痛等為主，嚴重影響患者治療期間和治療后的生活質量[1]。目前，常規治療藥物三乙醇胺乳膏作用較為局限[2]，研究表明，中醫藥在治療放射性皮炎方面療效較好[3]。黃芪有“瘡家要藥”之稱，實驗和臨床證據表明，黃芪的主要成分黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)可有效改善皮膚血液循環，增強局部抗病能力，促進局部病灶愈合，因此在臨床上常被用于蕁麻疹、老年性皮膚瘙癢、燙傷、濕疹等皮膚病的治療[4]。課題組前期研究發現，黃芪可有效抵御放射性皮炎，本研究通過建立放射性皮炎小鼠模型探討黃芪多糖防御放射性皮炎的分子機制，以期為臨床治療提供理論基礎。

1 材料

1.1 實驗動物

健康清潔級昆明小鼠，雄性，體質量18～22 g，由蘭州大學實驗動物中心提供，動物許可證書號：SCXK(Gan)2019-0723，動物合格證號：62001000002146，動物飼養于室溫(23±2)℃、相對濕度(50±5)% ，水、食自由攝取，適應性喂養1周，所有小鼠實驗均按照動物保護法進行，并經蘭州大學第一醫院倫理委員會批準。

1.2 試藥與儀器

藥物與試劑：三乙醇胺乳膏(法國Johnson公司，批號：20120425)，黃芪多糖(西安明澤生物科技有限公司，純度>90%，批號：89250-26-0)；水合氯醛注射液(北京雷根生物技術有限公司，批號：20186739)，HE染色試劑盒(上海尚寶生物科技有限公司，批號：R23261)，TNF-α、IL-6、bFGF、VEGF、EGF試劑盒均采購自武漢賽培生物公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶有限公司，批號：20192452)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京索萊寶有限公司，批號：20191135)，二抗抗兔(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：123721)，ECL顯色試劑(美國Millipore公司，批號：18428671)。

儀器：Unique型直線加速器(美國VARIAN醫療設備有限公司)，Q550CW圖像信號采集與分析系統(德國制造)。

2 方法

2.1 放射性皮炎動物模型的建立

使用10%水合氯醛水溶液麻醉小鼠，8% Na2S溶液對小鼠背部皮膚脫毛，面積約4 cm×4 cm。用Varian加速器(SL-1800型)，6 MeV電子線，吸收計量率400 cGY·min-1，吸收劑量40 GY，每天照射1次，連續照射5 d[5]。

2.2 給藥與分組

昆明種小鼠共80只，共分為4組，每組20只，分別為正常組、模型組、黃芪多糖組和三乙醇胺乳膏組，黃芪多糖組和三乙醇胺乳膏組每日9∶00、14∶00、19∶00各涂藥1次，每次涂藥量以均勻覆蓋創面為宜，用藥期間每天觀察、記錄病變情況。

2.3 療效評定標準

記錄創面愈合情況，創面的測量：分別于第1周、第2周、第3周用標尺測量創面，拍攝各組創面后使用image Pro Plus6.0軟件分析創面面積，計算創面面積大小。創面愈合率：采用紙片增重法進行評價，即在創面貼透明薄紙后勾勒出創面形狀，再將質地均勻的硬紙板依所勾勒透明薄紙形狀和大小準確裁剪，然后將所裁紙板稱重，記錄質量。如用藥第1天，紙片重為G1，用藥第1周(7 d)，紙片重為G7，則創面愈合率H%=(G1-G7)/G1×100%，愈合率越大，療效越好[6]。治療3周后采用HE染色觀察皮膚病理變化，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)水平，qPCR和蛋白印跡法(Western blot)檢測皮膚組織中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)水平。bFGF、VEGF、EGF引物序列見表1。

表1 bFGF、VEGF、EGF引物序列

2.4 統計學分析

3 結果

3.1 小鼠創面的愈合情況

治療1周后，三乙醇胺乳膏組小鼠創面愈合率高于模型組(P<0.05)，差異有統計學意義；治療2周和3周后，黃芪多糖組、三乙醇胺乳膏組小鼠創面愈合率高于模型組(P<0.05)，差異均有統計學意義；黃芪多糖組與三乙醇胺乳膏組小鼠創面愈合率相比，差異無統計學意義，見圖1、表2。

圖1 第3周時各組小鼠創面的愈合情況

表2 各組小鼠創面愈合率情況

3.2 小鼠創面病理組織學情況

HE染色結果顯示，模型組表皮角化，部分表皮內水泡形成，真皮充血水腫，可見淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤及大量損傷細胞；黃芪多糖組、三乙醇胺乳膏組表皮角化降低，損傷程度明顯改善，創面組織修復程度優于模型組，見圖2。

圖2 第3周時各組小鼠創面病理組織學變化(HE，×200)

3.3 小鼠血清中TNF-α和IL-6水平變化

與正常小鼠相比，第3周模型組小鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型小鼠相比，黃芪多糖組和三乙醇胺乳膏組小鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.05)；黃芪多糖組與三乙醇胺乳膏組小鼠血清TNF-α、IL-6水平無明顯變化(P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平情況

3.4 PCR檢測皮膚組織中bFGF、VEGF、EGF mRNA水平變化

與正常組相比，第3周模型組、黃芪多糖組和三乙醇胺乳膏組小鼠bFGF、VEGF、EGF mRNA水平顯著升高(P<0.05)，差異有統計學意義；與模型組相比，黃芪多糖組和三乙醇胺乳膏組小鼠血清bFGF、VEGF、EGF mRNA水平顯著降低(P<0.05)，差異有統計學意義；黃芪多糖組與三乙醇胺乳膏組小鼠皮膚組織中bFGF、VEGF、EGF mRNA水平相比，差異無統計學意義，見表4。

表4 各組小鼠皮膚組織中bFGF、VEGF、EGF mRNA表達情況

3.5 蛋白印跡法檢測皮膚組織中bFGF、VEGF、EGF蛋白水平變化

與正常組相比，第3周模型組小鼠bFGF、VEGF、EGF蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，黃芪多糖組和三乙醇胺乳膏組小鼠血清bFGF、VEGF、EGF水平顯著降低(P<0.05)；黃芪多糖組與三乙醇胺乳膏組小鼠皮膚組織中bFGF、VEGF、EGF蛋白水平相比，差異無統計學意義，見表5。

表5 各組小鼠皮膚組織中bFGF、VEGF、EGF蛋白表達水平情況

4 討論

放射性皮炎是由于放射線照射引起的皮膚黏膜炎癥性損害，其中以X射線、γ射線最常見，其臨床表現為皮膚干燥、瘙癢、燒灼感，久之皮膚色素沉著，出現水皰、皮膚潰爛等。本病作為惡性腫瘤常見的并發癥，對患者的生活質量造成嚴重影響，嚴重者甚至會迫使患者中斷放療。

TNF-α、IL-6是與炎癥有關的常見因子，有學者認為，放射性皮炎的分子學機制主要包括誘導急性和慢性炎癥反應，本研究結果顯示，在治療3周后，黃芪多糖組小鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著降低，這可能與黃芪多糖改善小鼠表皮組織角化，減輕真皮充血水腫，抑制大量炎癥因子的釋放，細胞浸潤有關，本研究HE染色也證實了這一點；另有學者段紫鈺等[7]通過建立大鼠放射性皮炎模型，使用雙草油涂抹照射皮膚局部，第14天時，ELISA檢測血清中TNF-α、IL-6水平明顯低于模型組(P<0.05)，與三乙醇胺乳膏效果一致。臨床研究顯示，在60例Ⅱ～Ⅲ放射性皮炎的頸胸部惡性腫瘤患者，在使用放膚膏治療后患者血清IL-6水平顯著下降，同時皮膚濕性滲液減輕、水腫消退，疼痛和癢感消退時間縮短[8]。此外，TNF-α、IL-6在特應性皮炎、接觸性皮炎等皮膚病中也有表達[9-10]。

bFGF是一種肝素結合生長因子，其主要作用是促進包括間葉細胞、神經外胚層和血管內皮細胞在內的一系列細胞的增殖，其在體內還具有潛在的促血管生成活性[11]；VEGF是一種強有力的生長和血管生成細胞因子，刺激內皮細胞增殖和存活，促進血管生成和血管通透性[12]；EGF生長因子是人體內本身存在的一種活性物質，它能刺激表皮細胞生長因子，促進受損皮膚的修復與再生，促進創面、傷口加速愈合[13]；本研究結果顯示，第3周時黃芪多糖組、三乙醇胺乳膏組小鼠皮膚組織中bFGF、VEGF、EGF mRNA水平和蛋白水平均降低，但仍高于正常組；在大鼠II度放射性皮炎模型的實驗中，使用蘆薈凝膠涂抹照射創面區，免疫組化檢測結果顯示，實驗組和對照組從第2天至第24天創面組織中VEGF的表達均逐漸降低，但實驗組在第10天后降低幅度大于對照組[14]。另有國內學者陳鵬飛等[15]使用60只大鼠建立放射性皮炎模型，三氧橄欖油外涂照射部位，每天2次，連續外涂30 d，結果顯示，三氧橄欖油組治療5 d、10 d、15 d和30 d后創面愈合率均高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)，隨著治療時間增加，bFGF、EGF灰度值也隨之降低，在治療后的第10天和第15天，三氧橄欖油組創面組織的bFGF、EGF灰度值與模型組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。由此可見，bFGF、VEGF和EGF不僅在放射性皮炎動物明顯組織中表達，同時其表達水平呈時間依賴性。

綜上所述，黃芪多糖可能通過介導bFGF、VEGF和EGF的表達來降低炎癥反應，促進小鼠創面皮膚愈合，從而發揮對放射性皮炎小鼠的保護作用。但本研究也存在一定局限，由于實驗動物數量較少、觀察時間較短、時間點較少，檢測指標單一，與其對應的抑制通路未進行驗證，后期有待進一步深入研究。