黃連解毒湯治療膿毒癥的網絡藥理學研究

董青青 章怡祎 叢億蕾 陳偉

摘要 目的：探索黃連解毒湯治療膿毒癥的核心作用靶點、主要活性成分及作用機制。方法：在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）以黃連、黃芩、黃柏、梔子為關鍵詞分別檢索，按照口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18的條件篩選，獲得黃連解毒湯各中藥的活性成分及其作用靶點;通過在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）、GeneCards、治療靶點數據庫（TTD）檢索膿毒癥的疾病靶點;將預測到的成分及其疾病靶點運用Cytoscape軟件進行中藥-成分-疾病-靶點網絡構建及分析，篩選核心靶點及主要活性成分，通過STRING數據庫結合Cytoscape軟件繪制蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡并進行網絡拓撲學分析，通過R語言運行后對核心靶點進行基因本體（GO）分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路注釋分析，設定閾值 P <0.05， Q <0.05，篩選具有顯著性差異的生物過程及信號通路。結果：篩選出黃連解毒湯78個成分和841個藥物靶點;這些共同靶點涉及147條生物過程包括TNF信號通路、趨化因子信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡通路等代謝通路，內分泌抵抗等與內分泌系統相關的通路。結論：黃連解毒湯中小檗堿、槲皮素、山柰酚等多種成分協同作用于AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路等，初步揭示了其在治療膿毒癥時的多成分、多途徑、多靶點協同作用的復雜機制過程，為未來實驗驗證奠定了理論基礎。

關鍵詞 黃連解毒湯;膿毒癥;網絡藥理學;作用機制

Mechanism of Huanglian Jiedu Decoction in the Treatment of Sepsis Based on Network Pharmacology

DONG Qingqing1，ZHANG Yiyi1，CONG Yilei2，CHEN Wei1

（1 Department of Intensive Care Medicine，LongHua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China; 2 Department of Endocrinology，LongHua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China）

AbstractObjective： To explore the core targets，main active components and mechanism of Huanglian Jiedu Decoction in the treatment of sepsis. Methods： The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） was searched，with 黃連（Rhizoma Coptidis），黃芩（Radix Scutellariae），黃柏（Cortex Phellodendri），and梔子（Fructus Gardeniae） as keywords.According to bioavailability（OB）≥30% and drug-likeness（DL）≥0.18，the active components and targets of each Chinese medicinal material in Huanglian Jiedu Decoction were obtained.Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM），GeneCards，and Therapeutic Target Database（TTD） were used to screen the targets of sepsis.Then the obtained predicted components and disease targets were input in Cytoscape to construct the network of Chinese medicinal material-components-disease-targets，and the core targets and main active components were screened.The protein protein interaction（PPI） network was plotted via STRING combined with Cytoscape and topological analysis was performed.After R language running，GO analysis and KEGG pathway annotation analysis were conducted on the core targets，with the thresholds of ?P <0.05 and Q<0.05，to screen the biological processes and signaling pathways with significant differences. Results： A total of 78 components and 841 targets of Huanglian Jiedu Decoction were screened，and 147 biological pathways were involved，including metabolic pathways such as tumor necrosis factor（TNF），chemokine，hypoxia-inducible factor 1（HIF-1），and apoptosis signaling pathways，and pathways related to the endocrine system such as AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications and endocrine resistance. Conclusion： Berberine，quercetin，kaempferol and other components in Huanglian Jiedu Decoction synergistically acted on the AGE-RAGE signaling pathway，TNF signaling pathway，etc.，which preliminarily revealed the complex multi-component，multi-pathway and multi-target synergistic mechanism of Huanglian Jiedu Decoction in the treatment of sepsis，and laid a theoretical foundation for future experimental verification.E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

Keywords Huanglian Jiedu Decoction; Sepsis; Network pharmacology; Mechanism

中圖分類號：R285 文獻標識碼：A ?doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.012

膿毒癥（Sepsis）是嚴重感染、嚴重創傷、燒傷、休克、外科手術后常見的并發癥，可導致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS）。以其在重癥監護室中的高發病率、高病死率、高治療費用而聞名，若并發感染性休克，病死率可高達80%[1-3]。因此結合中西醫療法的各自優勢，提高治療效果，縮短住院天數，降低其病死率，是當前迫切需要解決的科學問題。

膿毒癥這一病名在中醫學中并未記載，中醫學者們以《傷寒論》和溫病學說作為理論基礎提出了膿毒癥的病機體現在本虛和標實2個方面。由于發病原因和人體體質的不同，根據正邪兩方面在疾病表現中所處地位，區別主次、先后，采取以扶正為主，兼顧祛邪，或以祛邪為主，兼顧扶正，隨機應變，掌握機宜，達到有效改善預后的目的，為臨床提供參考[4-5]?，F代學者將膿毒癥的證型及治法概括為“三證三法”，即毒熱證與清熱解毒法，瘀血證與活血化瘀法，急性虛證與扶正固本法[6]。

黃連解毒湯最早載于葛洪所著的《肘后備急方》，由黃連、黃芩、黃柏以及梔子按照3∶ 2∶ 2∶ 3的比例配伍而成。黃連解毒湯具有清熱解毒之功效，用于治療三焦火毒所致的熱甚發斑、熱病吐血、衄血、濕熱黃疸或外科的癰瘍疔毒等疾病。臨床常用于治療膿毒癥、痢疾、肺炎等熱毒癥患者[7]。研究發現，黃連解毒湯具有顯著的抗炎、抑菌、抗氧化、抗血栓及免疫調節的作用[8-10]。由此可見黃連解毒湯對膿毒癥的治療有著舉足輕重的作用，但該中藥復方的有效活性成分及其作用靶點和機制仍須進一步研究。本研究依托于網絡藥理學方法預測黃連解毒湯治療膿毒癥的潛在作用靶點及其機制，為臨床干預治療提供新的思路。

1資料與方法

1.1藥物成分及靶點篩選

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中檢索黃連解毒湯中各藥物的成分作為潛在活性成分[11]，并根據口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18進行篩選[12]，使用PubChem數據庫獲得上述成分的SDF格式化學結構，導入Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），取預測得分大于0的靶點作為藥物靶點[13]。

1.2膿毒癥作用靶點篩選

使用在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org/）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、治療靶點數據庫（Therapeutic Target Database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）以“Sepsis”為關鍵詞進行檢索，將上述3個數據庫的靶點數據匯總，去重后獲得疾病作用靶點。

1.3藥物-疾病共同靶點的篩選

在Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）上輸入藥物靶點及疾病靶點，繪制韋恩圖。

1.4中藥-成分-疾病-靶點網絡構建及分析

使用Cytoscape 3.7.2軟件（http：//www.cytoscape.org），構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖，其中網絡中節點（Node）表示黃連解毒湯的4味中藥、活性成分及潛在靶點，節點之間則以邊（Edge）相連。使用Network Analyzer工具計算網絡拓撲參數，根據節點連接度（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality）及緊密度中心性（Closeness Centrality）對黃連解毒湯的網絡拓撲結構進行分析[14-16]。

1.5蛋白質-蛋白質相關作用關系網絡構建

將上述139個共同靶點輸入到Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins數據庫（STRING，http：//string-db.org/）[17]中進行檢索，設置蛋白種類為“Homo Sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，獲取靶點相互作用的網絡關系數據，將其導入Cystoscap 3.7.2軟件，繪制蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡圖。

1.6基于拓撲分析的核心靶點篩選

將PPI網絡導入Cystoscap 3.7.2中，通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，以Degree，Betweenness Centrality，Average Shortest Path Length和Closeness Centrality這4個參數為參考標準[18]，通過Degree排序，選取分值大于平均分的基因作為核心靶點，將前30個靶點使用R3.6.0繪制條形圖。

1.7基于聚類分析的核心靶點篩選

將已經構建好的PPI網絡導入Cytoscape 3.7.2中，使用MCODE模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選[19-20]。E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

1.8靶點的生物功能及通路富集分析

利用R語言的clusterProfiler工具包[21]將基因Symbol轉為基因ID，對靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）生物過程富集和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，保存結果，設定閾值 P <0.05， Q <0.05，篩選具有顯著性差異的生物過程及信號通路。

2結果

2.1黃連解毒湯的潛在活性成分

查找出黃柏、黃連、黃芩、梔子的化學成分分別為黃柏37個、黃連14個、黃芩36個、梔子15個，合并后刪除重復成分共得到潛在活性成分85個。使用Swiss Target Prediction數據庫篩選出黃連成分作用靶點448個、黃柏成分作用靶點699個、黃芩成分442個、梔子成分373個，最后排除重復作用靶點和非人體作用靶點得到841個藥物靶點。見表1。

2.2膿毒癥的潛在作用靶點

將OMIM、GeneCards、TTD數據庫獲得的膿毒癥相關藥物靶點去重，共獲得疾病靶點816個。將841個藥物靶點、816個疾病靶點繪制韋恩圖，二者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點139個。見圖1。

2.3疾病-成分-靶點核心網絡

將黃連解毒湯中85個潛在活性成分與139個藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape軟件中，刪除7個與疾病靶點無交集的活性成分，并繪制出“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網絡圖。圖中紫色長方形代表藥物，藍色三角形代表各活性分子，綠色圓形代表靶點，紅色菱形代表疾病。見圖2。對網絡圖進行拓撲分析可以看出，一個活性成分可作用于多個靶點，作用靶點數量前5位的化合物分別為：5，2′-二羥基-6，7，8-三甲氧基黃酮（5，2′-Dihydroxy-6，7，8-Trimethoxyflavone），5-羥基-7，8-二甲氧基黃酮（Moslosooflavone），黃芩酮Ⅱ（SkullcapflavoneⅡ），5，7，2，5-四羥基-8，6-二甲氧基黃酮（5，7，2，5-Tetrahydroxy-8，6-Dimethoxyflavone），半枝蓮種素（Rivularin），這些化合物有可能在治療膿毒癥過程中起著重要的作用。見表2。

2.4PPI網絡的構建及關鍵靶點篩選

PPI網絡圖共有78個靶點可發生蛋白質-蛋白質相互作用，有2 324條相互作用連接線，平均度值為33.4。根據Degree值大小進行排序，Degree值越大，說明該節點很可能就是關鍵成分或關鍵靶點。見圖3～4。

2.5PPI網絡聚類結果

使用MCODE插件將黃連解毒湯靶點PPI網絡進行聚類分析，總共得到5個基因簇和4個核心基因，核心基因為TNFRSF1A、AGTR1、F2、CYP2C19。見表3，圖5。

2.6靶點蛋白GO分析

將139個共同靶點經R語言運行，GO結果顯示，黃連解毒湯治療膿毒癥共涉及2 256條生物過程（Biological Process，BP）通路，其中主要包括白細胞遷移（Leukocyte Migration）、對外界刺激的積極調節反應（Positive Regulation of Response to External Stimulus）、肽基酪氨酸磷酸化（Peptidyl-Tyrosine Phosphorylation）等。共有74條細胞組分（Cell Component，CC）表達過程，主要涉及膜筏（Membrane Raft）、膜區（Membrane Region）、細胞質囊泡腔（Cytoplasmic Vesicle Lumen）、肥大細胞顆粒（Mast Cell Granule）、含膠原的細胞外基質（Collagen-Containing Extracellular Matrix）等。141個與分子功能（Molecular Function，MF）相關的過程，主要集中于非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性（Non-Membrane Spanning Protein Tyrosine Kinase Activity）、磷酸酶結合（Phosphatase Binding）、蛋白質酪氨酸激酶活性（Protein Tyrosine Kinase Activity）、絲氨酸水解酶活性（Serine Hydrolase Activity）、蛋白磷酸酶結合（Protein Phosphatase Binding）。見圖6～8。

2.7KEGG通路富集分析篩選出147條KEGG通路，將前20的結果繪制成條形圖。這些通路包括了卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi Sarcoma-Associated Herpesvirus Infection）、TNF信號通路（TNF Signaling Pathway）、人巨細胞病毒感染通路（Human Cytomegalovirus Infection）。見圖9。

3討論

3.1組方分析

黃連解毒湯主治三焦積熱，邪火妄行，故用黃芩瀉肺火于上焦，黃連瀉脾火于中焦，黃柏瀉腎火于下焦，梔子通瀉三焦之火，從膀胱而出。蓋陽盛則陰衰，火盛則水衰，故用大苦大寒之藥，抑陽而扶陰，瀉其亢盛之火，而救其欲絕之水，然非實熱，不可輕投[7]。根據現代藥理學的研究，發現黃連解毒湯具有抑制耐藥性、抗氧化、抗血栓形成、降糖、調脂、保護心肌、增強免疫調節等優點，最重要的是可以抗炎，抑菌，抗內毒素及保護腦功能[22]。在現代臨床研究中，黃連解毒湯被廣泛應用于各種疾病的治療中，尤其是在急性感染性疾病方面，如膿毒癥、急性感染性心內膜炎、重癥肛周膿腫、急性百草枯中毒、急性盆腔炎等[23]。E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

3.2成分分析

研究結果發現黃連解毒湯潛在活性成分的口服生物利用度高，作用靶點廣泛。根據已有文獻進一步分析，小檗堿作為黃連和黃柏的主要藥效物質基礎，其能夠改善學習記憶能力、保護心肌缺血的再灌注損傷、抗糖尿病、抗炎、降脂。鹽酸巴馬汀具有和小檗堿相似的化學結構，能有效抗炎、抗菌、抗病毒和降血糖等[24-25]。羅煜等[26]的研究表明，鹽酸巴馬汀可同時作用于核因子κB/p38MAPK信號通路和NLKP3炎癥小體信號通路上，最終減少炎癥介質的釋放，起到良好的抗炎功效。黃芩中的黃芩苷通過對icaA和cida基因表達的降低，影響細胞間多糖黏附素（PIA）的合成和細胞外DNA（eDNA）的釋放，從而對金黃色葡萄球菌生物被膜的形成產生抑制作用[27]。此外黃芩苷還有顯著的抗炎[28]、抗病毒[29]、清除自由基[30]、抗氧化[31]、保護腎臟[32]、抑制心肌缺血[33]和免疫調節作用[34]。山柰酚為梔子中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病原微生物和心血管系統保護的作用[35]。槲皮素（Quercetin），又名櫟精，是一種黃酮類化合物，具有抗氧化應激、抑菌、抗病毒、調節免疫及抗血小板聚集等藥理作用[36-39]。

3.3靶點分析

根據Degree值大小排序，對排名前30位靶點根據相關文獻進一步分析。其中血清白蛋白（Serum Albumin，ALB）是人類血液中最豐富的蛋白質。該蛋白在調節血漿膠體滲透壓中起作用，并充當多種內源性分子（包括激素，脂肪酸和代謝產物）以及外源性藥物的載體蛋白，具有抗氧化和抗炎特性，可作為活性氧[40-41]和氮[42]的清除劑，并且可作為酸堿平衡的緩沖分子[43]。感染性休克患者的特點是內皮屏障滲漏增加，ALB和高密度脂蛋白（High Density Lipoprotein，HDL）顯著丟失[44-45]。一磷酸鞘氨醇（Sphingosine Monophosphate，S1P）是一種重要的免疫調節劑，負責淋巴細胞的發育、T細胞和B細胞的定位和遷移以及細胞因子的分泌等生理細胞反應[46]。ALB和HDL等S1P載體分子參與了S1P效應的調控[47]。因此，膿毒癥患者的S1P濃度也會降低，特別是在感染性休克患者中。

同時，一個靶分子可被不同活性成分靶向作用，如MAPK14、MPO、TLR8等。MAPK14可以參與炎癥反應中細胞因子的產生，正向調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄，在膿毒癥的發病過程中起到關鍵作用[48]。髓過氧化物酶是嗜中性粒細胞浸潤的標志，是氧化應激的標志[49]。在膿毒癥早期，髓過氧化物酶的產生超過人體的抗氧化防御能力，這種不平衡可以導致直接的線粒體損害，甚至能夠導致器官衰竭[50-51]。此外，其他的研究表明，降低膿毒癥的氧化應激可以作為一種線粒體保障策略[52-53]。因此，髓過氧化物酶可能是膿毒癥的潛在治療靶點。TLR8是Toll樣受體（TLR）家族的成員，因其能夠識別來自乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV），人免疫缺陷病毒（HIV）和流感病毒的單鏈RNA（ssRNA）的能力而聞名。最近，一些研究證實，TLR8介導的RNA識別在金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌和萊姆病螺旋體感染的檢測中起著至關重要的作用[54-56]。影響TLR8活性的溶酶體功能抑制對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌感染均具有抗炎作用，這意味著TLR8的抑制可作為膿毒癥的一種潛在治療手段[55]。

此外，本研究通過對黃連解毒湯PPI網絡進行聚類分析得出了其中顯著性較強的4個模塊，其中模塊1中包含TNFRSF1A、IL-2、TNF、TLR8、TLR7等炎癥相關因子。當病原微生物入侵機體時，激活細胞因子釋放炎癥介質，這表明黃連解毒湯能夠通過抑制炎癥反應發揮治療作用。

腎素-血管緊張素系統（Renin Angiotensin System，RAS）在膿毒癥中被激活，不僅與膿毒癥中的微血管功能障礙有關，還貫穿臟器功能紊亂的始終[57]。最近，Zhang等[58]已證明RAS的低表達與嚴重膿毒癥患者的不良預后相關。血管緊張素作為RAS的重要環節，其中腎素血管緊張素Ⅱ（Renin Angiotensin Ⅱ，Ang-2）與膿毒癥的炎癥反應、細胞凋亡、血管滲漏等病理過程密切相關。目前相關研究表明，嚴重膿毒癥患者的Ang-2和腎素水平升高，而升高的程度與反應性充血期間的微血管復氧率負相關[57]。模塊2中的核心基因為AGTR1（AT1），AT1作為Ang-2的主要受體，大多數已知的Ang-2的作用是由AT1介導的。AT1具有調節血管收縮作用，并參與Ang-2調控炎癥，研究表明AT1在膿毒癥患者體內下調[59]。

通過此網絡驗證了黃連解毒湯治療膿毒癥是通過多成分、多靶點、共同調節的方式發揮作用的。

3.4通路結果分析

通過GO富集分析發現黃連解毒湯治療膿毒癥的78個潛在關鍵靶點基因的主要生物過程涉及炎癥反應、氧化應激、細胞因子的分泌調節、細胞凋亡調控等。分子功能包括蛋白激酶結合、受體活性、細胞因子活性、激酶活性調控等方面;細胞組分則主要富集在細胞區域、細胞質膜和線粒體等方面。

黃連解毒湯的KEGG通路富集結果表明，其絕大部分基因富集在TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、EB病毒感染、趨化因子信號通路、HIF-1信號通路、甲型流感等炎癥通路，破骨細胞分化通路、細胞凋亡通路等代謝通路，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、內分泌抵抗等與內分泌系統相關的通路。

眾所周知，核因子κB是炎癥反應中的主要轉錄因子，廣泛的細胞外刺激如病毒、細菌和酵母產物與不同的Toll樣受體（TLR）相互作用，以及TNF、IL-1分別與TNF受體1（TNFR1）和IL-1受體（IL-1R）結合均能激活核因子κB通路，以響應各種刺激[60]。E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

研究表明，糖基化終末產物（AGEs）能結合細胞膜上RAGE，上調炎癥反應并導致組織細胞的破壞[61]，并且能夠導致氧化應激和細胞功能不良，自由基產生以及核因子κB的活化[62]。核因子κB則能夠誘導促進細胞因子IL-6、TNF-α、IL-α等的釋放，從而引起炎癥反應[63]。蔡紅蝶等[64]的實驗表明AGEs作用于腸道L細胞（GLUTag），通過上調細胞RAGE表達，從而激活NADPH氧化酶，升高p38MAPK磷酸化水平，促使核因子κB表達，釋放炎癥介質，其發病機制與本研究預測具有一致性，而黃酮類成分能顯著調節GLUTag細胞中AGEs/RAGE/p38MAPK/核因子κB信號通路。但AGE-RAGE軸在導致多器官衰竭和死亡的過度炎癥反應中的相關實驗研究較少，本研究可為黃連解毒湯治療膿毒癥的進一步實驗研究提供參考。

綜上所述，本研究依托網絡藥理學，對黃連解毒湯治療膿毒癥的化學成分、作用靶點和相關信號通路進行系統分析和探討，預測了黃連解毒湯中小檗堿、槲皮素、山柰酚等多種成分協同作用于AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路等，初步揭示了其在治療膿毒癥時的多成分、多途徑、多靶點協同作用的復雜機制過程，為未來實驗驗證奠定了理論基礎。

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（2021-03-03收稿本文編輯：魏慶雙）

基金項目：上海市重大危重醫療事件中西醫協同響應與干預平臺建設項目（ZY2018-2020-FWTX-7004）作者簡介：董青青（1994.07—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中西醫結合治療急危重癥，E-mail：sixi16602152267@163.com通信作者：陳偉（1962.07—），男，博士研究生，主任醫師，博士研究生導師，研究方向：心血管和危重病的中西醫結合防治，E-mail：cwdoctor@163.comE252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1