我國野生燕山葡萄VyUSP1基因抗逆功能的初步驗證

高換超 許雯雯 井朋偉 程珊珊 侯小進 李桂榮

摘要：研究我國野生葡萄燕山葡萄（Vitis yeshanesis ‘Yanshan’）VyUSP1基因在轉基因煙草不同逆境下的表達情況，選擇從供試材料中克隆所獲得的VyUSP1基因，利用重組法構建其載體，并用農桿菌介質為導體轉化轉基因煙草植株，獲得USP轉基因煙草植株，然后對轉基因煙草植株進行不同逆境處理，并對該基因進行初步的功能研究。結果表明，在不同的逆境條件下，USP轉基因煙草均具有一定的抗干旱能力，但是不具備抗寒能力。較高濃度NaCl、甘露醇、PEG-6000以及低溫處理會抑制轉基因煙草種子的萌發。而在不同濃度NaCl、甘露醇處理下，轉基因煙草植株幼苗均比野生型（WT）植株幼苗的表現要好;不同濃度PEG-6000處理對轉基因煙草幼苗生長的影響并不明顯;但在低溫處理條件下，轉基因煙草植株幼苗全部死亡。植物在受到外界脅迫時VyUSP1基因的表達會上調，蛋白活性被激活之后，有助于提高植物的抗逆性，增強其環境的適應性，因此USP對逆境脅迫存在一定的抗性。

關鍵詞：燕山葡萄;VyUSP1基因;轉基因煙草;逆境脅迫;功能驗證

中圖分類號：S663.101 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）10-0159-07

普遍脅迫蛋白（universal stress protein，USP）是一種普遍存在于植物中的抗逆性相關蛋白，所有蛋白質至少含有1個USP結構域和其他催化基序，在特定的組織、器官和發育階段或在不同的脅迫條件下差異表達[1-2]。USP屬于自磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的磷酸蛋白，可作為三磷酸鳥苷（GTP）和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的磷酸供體。

目前，在植物逆境分子生理研究中，都有克隆到USP基因的報道，在水稻、棉花、擬南芥等全基因組測序的情況下，很多物種中都發現并克隆到了USP基因[3-8]。USP在水稻中至少由10個基因編碼，在擬南芥中由17個基因編碼，并且都位于第5條染色體上。在亞細胞水平上，USP基因被定位存在于細胞質中，能夠參與大量的脅迫應答反應[4-5]。Chou等研究發現，當細胞受到外界環境脅迫時，該基因的表達會明顯上調，蛋白活性被激活，有助于提高其抗逆性，增強其適應性[6-7]。Udawat等研究發現，USP在海蓬子（Salicornia brachiata）耐鹽脅迫中起著至關重要的作用;SbUSP基因主要通過清除轉基因煙草細胞內的活性氧，顯著提高了煙草的耐鹽性[8]。在大豆植物中，黃姍等將克隆得到的大豆GmUSP1基因對其進行不同濃度的NaCl、脫落酸（ABA）、聚乙二醇（PEG）6000脅迫處理，分析發現耐鹽品種和感鹽品種對脅迫誘導響應時間和表達量存在差異，推測該基因可能參與逆境脅迫的應答調控[9]。Loukehaich從番茄基因組中克隆SlUSP1基因，通過表達模式分析發現該基因在植物中具有組織特異性，在鹽、高低溫、干旱及ABA逆境條件下候選基因被誘導[10]。趙莘對葡萄VpUSP基因的研究表明，該基因在與白粉病病菌互作過程中具有表達活性[11]。

我國是葡萄屬植物的重要起源地之一，具有豐富的野生葡萄屬種質資源，對野生葡萄資源抗逆機制的研究有重要意義，但關于葡萄USP基因在抗逆性方面的研究較少。本研究以我國野生燕山葡萄（Vitis yeshanensis ‘Yanshan’）為材料，克隆獲得VyUSP1基因，轉基因獲得USP煙草植株，然后對轉VyUSP1基因煙草植株進行不同逆境處理，對該基因抗逆功能開展研究，有助于探討燕山葡萄中VyUSP1基因的功能，以期為燕山葡萄資源的利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為中國野生燕山葡萄、本氏煙草（Nicotiana benthamiana）。

試驗地點為河南科技學院園藝園林學院分子生物學實驗室;試驗時間為2020年3—12月。

1.2 試驗方法

1.2.1 燕山葡萄VyUSP1基因在煙草中的功能研究

1.2.1.1 構建植物表達載體pBI121-VyUSP1，將其導入根癌農桿菌GV3101。

（1）步驟1：VyUSP1基因的克隆。

總RNA的提取。采用Trizol方法提取葡萄葉片總RNA;取RNA 1 μg，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，利用核酸蛋白檢測儀檢測其純度及濃度。

相關基因片段的擴增?；驍U增體系體積為50 μL：分別加入2 μL模板、引物和dNTP;0.4 μL LA酶;5 μL 10×LA Buffer，最后加入ddH2O補齊50 μL。PCR程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性 30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，變性至延伸步驟循環30次;72 ℃再次延伸10 min，16 ℃保持10 min，4 ℃保存。

擴增產物與克隆載體pMD18-T連接后轉化至大腸桿菌DH5α感受態中，篩選陽性克隆進行測序鑒定。連接pMD18-T體系總體積為10 μL：擴增產物7.5 μL、pMD18-T 0.5 μL、10×T4 ligase Buffer 1 μL、T4 ligase 1 μL。需16 ℃連接2～5 h。轉化流程：大腸桿菌DH5α感受態放在冰上4～5 min使其完全溶解之后將連接pMD18-T的連接液加入到感受態管中，靜置30 min，42 ℃水浴2 min，取出后立即放冰上2 min。在無菌操作臺中向感受態管中加入400 μL液體LB培養基，標記封口后放于37 ℃搖床上，160～200 r/min振蕩1 h。取出后12 000 r/min離心2 min，去除部分上清液，剩余菌液吸打均勻，涂在LB固體培養基上，標記封口后在37 ℃條件下倒置培養14 h。

（2）步驟2：構建VyUSP1基因表達載體。

用限制性內切酶XbaⅠ和SmaⅠ酶切重組載體pBI121-G，分別回收目的片段和表達載體片段，用ExnaseⅡ 37 ℃連接30 min后轉化至大腸桿菌DH5α感受態中，得到的菌液進行質粒提取后轉化到根癌農桿菌GV3101中即可。酶切連接體系總體積為 40 μL：pB121-G 10 μL、BSA 4 μL、1×T Buffer 4 μL、XbaⅠ 1 μL、SmaⅠ 1 μL、ddH2O補齊至 40 μL。此體系37 ℃連接2 h。酶切連接體系總體積為40 μL：載體片段與擴增片段、ExnaseⅡ各0.5 μL、5×CEⅡBuffer 5 μL，ddH2O補齊至40 μL。37 ℃連接30 min。

（3）步驟3：利用農桿菌介導葉盤法轉化本氏煙草。

轉化流程：從無菌試管苗上分別剪取煙草葉片，切成0.5 cm×0.5 cm的葉塊，MS培養基預培養 3 d;挑取單菌落，接種于含卡那霉素（Kan） 60 μg/mL、慶大霉素（Gent） 30 μg/mL 的LB液體培養基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養過夜;取 200 μL 新鮮菌液接種于20 mL LB培養基中培養至生長對數期，4 ℃、5 000 r/min 離心5 min;收集沉淀，并用MS液體培養基重懸沉淀，并置于28 ℃恒溫搖床，200 r/min培育2 h（D600 nm=0.5）;將預培養的葉片浸入準備好的農桿菌菌液中培養5 min，取出葉片，置于無菌濾紙上，除去葉盤表面多余的農桿菌菌液;將上述葉盤轉入MS培養基，25 ℃黑暗條件下共培養2 d;將共培養后的葉片轉入分化培養基MS+1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.3 mg/L 萘乙酸（NAA）+25 mg/L 潮霉素（HygB）+500 mg/L 羧芐西林（Carb），25 ℃ 培養;待芽長到1.5 cm左右時，切下轉移到生根培養基MS+0.3 mg/L NAA+25 mg/L HygB+500 mg/L Carb中，進行生根培養。

1.2.1.2 種子逆境脅迫處理

用NaCl、PEG-6000、甘露醇溶液和不同溫度處理轉基因煙草植株與野生型煙草植株T2種子。NaCl處理：0、150、300 mmol/L NaCl;干旱處理：0、150、300 mmol/L甘露醇;高滲透處理：對照、15%、30% PEG-6000;低溫處理：4、-10、-20 ℃處理。然后分別在0～15 d統計種子的發芽率。發芽率=發芽種子數/種子總數×100%。

1.2.1.3 幼苗逆境脅迫處理

用NaCl、PEG-6000、甘露醇溶液和不同溫度處理轉基因煙草植株與野生型（WT）煙草植株幼苗。NaCl處理：0、150、300 mmol/L NaCl;干旱處理：0、150、300 mmol/L甘露醇;高滲透處理：對照、15%、30% PEG-6000;低溫處理：4、-10 ℃處理。統計存活率，存活率=存活幼苗數/幼苗總數×100%。

1.2.2 燕山葡萄VyUSP1啟動子功能驗證 （1）構建燕山葡萄VyUSP1基因啟動子的植物表達載體（所用載體為pBI121）。（2）利用葉盤法轉化煙草。（3）轉基因煙草植株幼苗的組織器官表達分析及對不同脅迫的響應;對根、莖、葉進行β葡萄糖苷酸酶（GUS）染色：幼苗分別用150 mmol/L NaCl、15% PEG-6000、150 mmol/L甘露醇進行GUS染色。（4）用GUS染色法驗證轉VyUSP1基因煙草植株成苗對滲透脅迫的響應。

2 結果與分析

2.1 USP啟動子GUS染色

不同濃度NaCl處理的轉基因煙草2、4、8、12、24 h 5個時間段中2、8、24 h均被染色，而WT幼苗均無染色表現;轉基因煙草植株在甘露醇和PEG-6000不同濃度處理中的2、8 h條件下，觀察發現轉基因植株葉片均被染色;在4 ℃處理中轉基因煙草植株葉片在2、4、8、12、24 h 5個時間段的染色情況與WT煙草幼苗的染色情況均無明顯變化。根據以上情況綜合分析表明，在NaCl處理中轉基因植株葉片的染色情況表現比較明顯，而其他處理中轉基因植株葉片染色情況相對微弱。

2.2 轉基因煙草種子在不同逆境處理下的發芽率

2.2.1 不同濃度NaCl處理對轉基因煙草種子發芽率的影響 由圖1、表1可以看出，種子播種在添加不同濃度NaCl的MS培養基上，培養0～15 d后，未添加NaCl處理的轉基因煙草種子和WT種子發芽率均為100.0%。150 mmol/L NaCl處理3 d后的轉基因煙草種子發芽率達到100%，處理7 d后的轉基因煙草種子發芽率達到41%，處理15 d后的轉基因煙草種子發芽率為33.3%。而300 mmol/L NaCl處理后的轉基因煙草種子發芽率從3 d到15 d變化幅度較大，從20.0%降到了0。綜上所述，轉VyUSP1基因煙草種子在150 mmol/L NaCl處理下，時間越長發芽率越低;隨著處理的NaCl濃度升高，轉VyUSP1基因煙草種子發芽率也降低，說明鹽脅迫濃度過高或者時間過長均對轉VyUSP1基因煙草種子發芽不利。

2.2.2 不同濃度甘露醇處理對轉基因煙草種子發芽率的影響

由圖2、表2可以看出，種子播種在添加不同濃度甘露醇的MS培養基上，培養0～15 d后，未添加甘露醇處理的轉基因煙草種子和WT種子發芽率均為100%。150 mmol/L甘露醇處理3 d后的轉基因煙草種子發芽率達到100.0%，處理7 d后達到95.6%，處理15 d后為62.2%。而 150 mmol/L 甘露醇處理WT種子0～15 d后發芽率較低。300 mmol/L 甘露醇處理轉基因煙草種子0～15 d后發芽率均低于150 mmol/L處理，說明較高甘露醇含量處理會抑制轉基因煙草種子的萌發。

2.2.3 不同濃度PEG-6000處理對轉基因煙草種子發芽率的影響

由表3可以看出，種子播種在添加不同濃度PEG-6000的MS培養基上，培養0～15 d后，未添加PEG-6000處理的轉基因煙草種子和WT種子發芽率均為100%。15% PEG-6000處理3 d后的轉基因煙草種子發芽率達到100%，處理7 d后達到26.7%，處理15 d后為20.0%。而15% PEG-6000處理WT種子0～15 d后發芽率較低30% PEG-6000處理轉基因煙草種子發芽率均為0，說明較高PEG-6000含量處理會抑制轉基因煙草種子的萌發。

2.2.4 低溫處理對轉基因煙草種子發芽率的影響

由圖3、表4可以看出，種子播種在MS培養基上，低溫培養0～15 d后，未低溫處理的轉基因煙草種子和WT種子發芽率均為100%。-10 ℃處理 3 d 后的轉基因煙草種子發芽率為33.3%，處理7 d后下降為26.7%，處理15 d為0%。而-10 ℃處理WT種子0～15 d后發芽率均高于轉基因煙草種子發芽率。-20 ℃條件下培養轉基因煙草和WT種子發芽率均為0，說明溫度低會抑制轉基因煙草種子的萌發。

2.3 不同逆境處理對轉基因煙草幼苗生長的影響

2.3.1 不同濃度NaCl處理對轉基因煙草幼苗生長的影響

由圖4可以看出，在150 mmol/L NaCl處理下WT植株幼苗和轉基因植株幼苗的生長狀況均出現了走向衰弱的趨勢，但是轉基因植株幼苗的生長勢較旺盛，其綜合情況要比WT植株幼苗的好;在300 mmol/L NaCl處理下WT植株幼苗株型矮小，生長勢弱且葉片狹小而轉基因煙草幼苗在這3個方面的狀況均優于WT幼苗的狀況，但兩者均有繼續生長的趨勢。

2.3.2 不同濃度甘露醇處理對轉基因煙草幼苗生長的影響

由圖5可以看出，在150、300 mmol/L甘露醇2個處理中，轉基因煙草植株幼苗的生長狀況比WT植株幼苗的表現要好。

2.3.3 不同濃度PEG-6000處理對轉基因煙草幼苗生長的影響

由圖6可以看出，30% PEG-6000處理轉基因煙草植株幼苗和WT植株幼苗均無生長跡象，并且在15%濃度處理下兩者差異不明顯。

2.3.4 不同低溫處理對轉基因煙草幼苗生長的影響

由圖7可以看出，在4 ℃處理下，轉基因煙草幼苗的生長勢優于WT幼苗，在-10 ℃低溫下，轉基因煙草幼苗和WT幼苗全部死亡。

3 討論與結論

應激蛋白是一種普遍存在于植物中的抗性相關蛋白，一般存在于細胞質中，在植物受到外界脅迫時表達上調，增強植物的抗逆性。葡萄容易受到鹽堿、干旱等逆境危害，危害嚴重的會給葡萄生產造成巨大的經濟損失。發掘葡萄種質的抗逆性基因，提高葡萄新品種的抗逆性是解決此問題的有效途徑之一。本試驗主要研究了我國野生葡萄燕山葡萄VyUSP1基因在轉基因煙草不同逆境下的表達情況，結果發現VyUSP1基因比較抗鹽和耐旱。陳瑩等研究發現，高羊茅（Festuca arundinacea Schreb）逆境脅迫蛋白基因FaUSP的超量表達可以增強菊苣的抗旱能力，推測該基因與抗旱性相關[12]。劉峻玲等研究青杄（Picea wilsonii）PwUSP1基因時，發現在干旱和鹽脅迫條件下，PwUSP1通過增強植物的活性氧（ROS）清除能力及抑制膜脂氧化損傷來提高植物對非生物脅迫的耐受性[13]。本試驗研究結果均與這些研究結果一致，植物在受到外界逆境刺激后，通過系列信號分子調節相關抗逆基因和蛋白的表達，進而改變自身表觀形態和生理生化水平來適應逆境[14-15]。在感覺到外部逆境刺激后，植物將外源信號導入細胞內下游信號通路，包括激活蛋白激酶或磷酸酶，刺激下游靶蛋白，以及植物激素的生物合成，以控制植物的生長發育[16-17]。特別是這些復雜信號交叉網絡精確地調節了脅迫反應基因的表達，并保護植物免受外部脅迫[15，18-20]。

本試驗以我國野生燕山葡萄為材料，克隆獲得VyUSP1基因，利用重組法構建其載體，并用農桿菌介質為導體轉化轉基因煙草植株，獲得USP轉基因煙草植株。然后對轉基因煙草植株進行不同逆境處理，探究該基因的抗逆性。研究結果表明，在不同的逆境條件下，USP轉基因煙草均具有一定的抗干旱能力，但是不具備抗寒能力。較高濃度NaCl、甘露醇、PEG-6000以及低溫處理會抑制轉基因煙草種子的萌發。而在不同濃度NaCl、甘露醇處理下，轉基因煙草植株幼苗均比WT植株幼苗的表現要好;不同濃度PEG-6000處理對轉基因煙草幼苗生長的影響并不明顯;但在低溫處理的條件下，轉基因煙草植株幼苗全部死亡。綜上所述，USP轉基因植株對逆境有一定的抗性，植物在受到外界脅迫時VyUSP1基因的表達上調，蛋白活性被激活，有助于提高植物的抗逆性，增強其環境適應性。

參考文獻：

[1]Li W T，Wei Y M，Wang J R，et al. Identification，localization，and characterization of putative USP genes in barley[J]. Theoretical and Applied Genetics，2010，121（5）：907 -917.

[2]Wang X F，Su J，Yang N，et al. Functional characterization of selected universal stress protein from Salvia miltiorrhiza （SmUSP） in Escherichia coli[J]. Genes，2017，8（9）：224.

[3]Gustavsson N，Diez A，Nystrom T.The universal stress protein paralogues of Escherichia coli are co-ordinately regulated and co-operate in the defence against DNA damage[J]. Molecular Microbiology，2002，43（1）：107 -117.

[4]Conrath U. Molecular aspects of defence priming[J]. Trends in Plant Science，2011，16（10）：524-531.

[5]Petrov V，Hille J，Mueller-Roeber B，et al. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants[J]. Frontiers in Plant Science，2015，6：69.

[6]Chou M X，Wei X Y，Chen D S，et al. A novel nodule-enhanced gene encoding a putative universal stress protein from Astragalus sinicus[J]. Journal of Plant Physiology，2007，164（6）：764 -772.

[7]Freestone P，Nystr m T，Trinei M，et al. The universal stress protein，UspA，of Escherichia coli is phosphorylated in response to stasis[J]. Journal of Molecular Biology，1997，274（3）：318 -324.

[8]Udawat P，Jha R K，Sinha D，et al. Overexpression of a cytosolic abiotic stress responsive universal stress protein （SbUSP） mitigates salt and osmotic stress in transgenic tobacco plants[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：518.

[9]黃 姍，王偉旗，侯文勝. 大豆Usp1基因的克隆和表達分析[J]. 大豆科學，2012，31（4）：546 -551.

[10] Loukehaich R. 廣譜脅迫蛋白編碼基因（SlUSP1）介導番茄抗旱性的研究[D]. 武漢：華中農業大學，2011.

[11]趙 莘. 中國野生華東葡萄抗白粉病基因（VpUSP）克隆及表達分析[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2010.

[12]陳 瑩，陳 錫，王 茜，等. 高羊茅逆境脅迫蛋白基因FaUSP的克隆、表達及生物學功能分析[J]. 生物技術通報，2021，37（2）：32-39.

[13]劉峻玲，梁珂豪，苗雅慧，等. 青杄PwUSP1基因特征及對干旱和鹽脅迫的響應[J]. 北京林業大學學報，2020，42（10）：62-70.

[14]Gilroy S，Biaasek M，Suzuki N，et al. ROS，calcium，and electric signals：key mediators of rapid systemic signaling in plants[J]. Plant Physiology，2016，171（3）：1606 -1615.

[15]Choudhury F K，Rivero R M，Blumwald E，et al. Reactive oxygen species，abiotic stress and stress combination[J]. The Plant Journal，2017，90（5）：856 -867.

[16]Sheikh A H，Eschen-Lippold L，Pecher P，et al. Regulation of WRKY46 transcription factor function by mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis thaliana[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：61.

[17]Akimoto-Tomiyama C，Tanabe S，Kajiwara H，et al. Loss of chloroplast-localized protein phosphatase 2Cs in Arabidopsis thaliana leads to enhancement of plant immunity and resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris infection[J]. Molecular Plant Pathology，2018，19（5）：1184 -1195.

[18]Sewelam N，Kazan K，Schenk P M. Global plant stress signaling：reactive oxygen species at the cross-road[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：187.

[19]Nejat N，Mantri N.Plant immune system：crosstalk between responses to biotic and abiotic stresses the missing link in understanding plant defence[J]. Current Issues in Molecular Biology，2017，23：1 - 16.

[20]沈彥輝，陳宏坤，高璐陽，等. 灰葡萄孢Bctre1的基因組定位、蛋白質結構預測及表達分析[J]. 山東農業科學，2020，52（3）：13-18.