7種青岡屬植物種子休眠類型鑒定及休眠打破

史喜兵 焦雪輝 申瀟瀟

摘要：為研究青岡屬（Cyclobalanopsis）植物種子休眠特性，縮短播種育苗周期，以7種青岡屬植物種子為材料，通過超微結構觀察、吸水性測定、白菜種子萌發受內源抑制物影響試驗，對休眠類型進行鑒定，并利用機械處理、激素處理等方法進行休眠打破。結果表明，7種青岡屬植物種子的種殼呈現非常明顯的3層結構，由外而內依次為角質層、外表皮細胞和內表皮細胞。角質層細胞石質化，形成蠟質層，非常堅硬;外表皮細胞呈柵欄狀排列，增加了種皮的厚度和硬度。去殼種子和劃口種子，其吸水率均高于種殼完整種子，說明種殼對種子的吸水性有一定的阻礙作用。經種殼和子葉浸提液培養的白菜種子萌發率降低，對其根和葉的生長有明顯的抑制作用，說明種殼和子葉中含有阻礙種子萌發的物質。去種殼及種殼劃口處理可以打破種子休眠，使萌發時間明顯提前，萌發率和發芽勢顯著提高。GA3處理對種子休眠打破影響不大，對部分樹種種子的發芽率和發芽勢有顯著提高作用。表明7種青岡屬植物種子的種殼影響胚的生長發育和種子的吸水性，種殼的物理阻礙作用是青岡種子休眠的主要因素。去種殼和種殼劃口處理是打破種子休眠的有效方法。

關鍵詞：青岡屬;休眠類型;休眠打破;機械處理;激素處理;種殼;子葉

中圖分類號： S722.1+4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）10-0151-08

種子休眠的現象普遍存在于高等植物中，是植物本身適應環境和延續生存的一種特性。胚未分化或發育未成熟、代謝抑制物等是導致種子休眠的內源性原因，胚外周組織的物理、機械或化學性抑制等是外源性原因[1]。Nikolaeva按照影響種子萌發的因素形成了一套種子休眠分類系統[2]。Baskin 等對這一分類系統進行了改進并提議作為國際通用的種子休眠分類系統，該系統主要包括物理休眠（physical dormancy，簡稱PY）、形態休眠（morphological dormancy，簡稱MD）、生理休眠（physiological dormancy，簡稱PD）、復合休眠（PY+PD）和形態生理休眠（morphophysiology dormancy，簡稱MPD）5種[3]。無論是農作物，還是林木、果樹、花卉，均存在種子休眠現象。

眾多學者對種子休眠因素和種子萌發特性進行了大量研究。相關研究表明，硬度較高、密度較大的種皮（包括果皮），可能由于上披油脂或蠟質，導致種子休眠[4]。郭聰聰等認為，白皮松種子成熟時，種胚已發育完整，胚外部覆蓋組織、內外種皮含有的抑制物是影響種子萌發的主要原因，胚乳對萌發無抑制作用[1]。耿文娟等發現，野生歐洲李種子各個部分的浸提液不影響白菜種子萌發，但對胚根生長有明顯的抑制作用，其各個部分的浸提液抑制白菜種子萌發的強弱表現為種胚>種皮>種殼[5]。有些植物種子還存在上胚軸休眠現象。仇云云等認為，紫斑牡丹種皮致密、種皮和胚乳含有阻礙萌發物質是胚軸休眠的原因，胚內部原因造成了上胚軸休眠，需要低溫解除休眠[6]。也通過機械處理、低溫層積、熱水浸種、化學藥劑浸種等方法，對打破種子休眠進行了研究。

青岡屬植物種子大多屬于頑拗性種子，不經歷成熟脫水，脫落時含水量相對較高，不耐干燥，一般情況下干燥至15%～20%含水量時大多數或者全部死亡。種皮和種殼堅硬致密是導致頑拗性種子休眠的重要原因。李金華研究過赤皮青岡（Cyclobalanopsis gilva）種子萌發特性，采用不同激素、不同果皮和種皮處理方式對種子進行處理，發現果皮和內種皮對種子萌發存在物理性抑制，去除種殼后種子可打破休眠，提高萌發率，激素處理也可以提高萌發率[7]。彭穎姝等研究過不同沙藏處理對青岡櫟種子萌發的影響，發現去種皮后種子發芽率明顯高于完整種子。種皮透氣性很差、透水性不受影響;低溫貯藏發芽率高于常溫貯藏[8]。李慶梅等研究了櫟屬7種植物種子的發芽抑制物，認為不僅種皮影響萌發，其種子內源抑制物也可能是種子休眠的原因[9]。目前對青岡屬種子休眠的研究多集中在休眠打破方法上，少有從形態結構及內源物質等方面對休眠因素進行系統研究。因此，本研究通過對7 種青岡屬植物種子超微結構、種殼吸水性及內源抑制物的研究，希望尋找到阻礙種子萌發的原因，并在此基礎上探索休眠打破的方法，為生產中提供種子萌發率、降低繁育成本提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020年秋季采集青岡屬植物種子，包括青岡（Cyclobalanopsis glauca）、小葉青岡（C. myrsinaefolia）、細葉青岡（C. gracilis）、赤皮青岡（C. gilva）、曼青岡（C. oxyodon）、多脈青岡（C. multinervis）、云山青岡（C. sessilifolia），其中青岡櫟、小葉青岡種子采集地點為中國林業科學研究院亞熱帶林業實驗中心年珠林場，赤皮青岡采集地點為浙江省慶元縣實驗林場，曼青岡和多脈青岡采集地點為湖北神農架，云山青岡采集地點為浙江省九龍山自然保護區。7個樹種分別標記為FC1、FC2、FC3、FC4、FC5、FC6、FC7，從中挑選大小均勻、飽滿、無病蟲害的種子，放置于鄭州市農林科學研究所實驗室，洗凈晾干備用。

1.2 休眠類型鑒定方法

1.2.1 超微結構觀察

取7個樹種新鮮種子的種殼，組織塊面積不超過3 mm2，用磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）輕輕漂洗干凈，標記好掃描面，放入電鏡固定液中2 h，最后保存于4°冰箱;固定好的樣品經 0.1 mol/L PBS（pH值7.4）漂洗3次，每次15 min;0.1 mol/L PBS（pH值7.4）配制1%鋨酸室溫避光固定1～2 h。0.1 mol/L PBS（pH值7.4）漂洗3次，每次 15 min;用梯度濃度為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%乙醇逐級處理，每次 15 min，然后用醋酸異戊酯處理15 min，再使用臨界干燥儀干燥后進行離子濺射儀噴鍍，置于Hitachi SU8100掃描電子顯微鏡下觀察。

1.2.2 種殼吸水性

分別取完整種子、劃口種子（從種子胚端開始，使用解剖刀向下對稱劃開種殼，至種子1/2～2/3處，露出種胚但不損傷種胚）及去殼種子各5粒，稱量后放入燒杯，加入40 mL蒸餾水，置于25 ℃恒溫環境，每隔一定時間取出種子，先用吸水紙吸掉表面水分，再用電子天平稱質量，重復3次，種子質量不再增加為止。前8 h，每浸泡2 h取1次，每次取5粒，之后每隔12～48 h可取1次，每次取5粒。使用如下公式計算種子吸水速率：

種子吸水速率=（吸水后種子質量-吸水前種子質量）/吸水前種子質量×100%。

1.2.3 內源抑制物對白菜種子萌發影響

1.2.3.1 甲醇浸提液的提取

取7個樹種新鮮的種子，剝開并分離種殼和子葉，分別稱取 4 g，放入預冷的研缽內研碎，加入20 mL 80%甲醇溶液，搖晃均勻，置于4 ℃恒溫冰箱浸提24 h，為充分浸提，每4 h晃動1次，24 h后過濾，按此方法連續浸提3次，將3次濾液倒入旋轉蒸發儀，減壓蒸干后蒸餾水沖洗，最后定容到100 mL作為培養液。

1.2.3.2 白菜種子萌發測定

挑選出部分飽滿的白菜種子，先用0.5%高錳酸鉀溶液消毒，蒸餾水沖洗干凈后自然風干備用。培養皿中放入濕潤的脫脂棉，脫脂棉上蓋1層濕潤的濾紙，加入25 mL培養液，對白菜種子進行萌發試驗，以蒸餾水為對照。每個培養皿中放入白菜種子30粒，每個處理3個重復，25 ℃恒溫光照培養箱培養。24 h后統計每個培養皿中發芽的白菜種子數量，以發芽長度超過種子直徑為標準，計算平均發芽率，48、72 h后測量根長，記錄生長情況。

1.3 休眠解除

挑選健康飽滿的青岡種子，去除雜質和有蟲種子，清洗干凈晾干，過種子篩進行分級。用3%高錳酸鉀溶液處理20 min，清水沖洗3次，將部分種子進行劃口和去殼處理。按照不同方法處理后，自種子發芽開始，每天記錄發芽數，種子連續15 d不再發芽時結束試驗（對照種子培養3個月）。計算發芽率和發芽勢。

1.3.1 種殼處理方式的影響

取FC1～FC7完整種子（T0）、劃口種子（T2）、去殼種子（T6）各15粒（表1），每組重復3次，常溫水浸泡48 h，放入光照培養箱，設置溫度25 ℃、8 h黑暗、16 h光照。

1.3.2 激素的影響

取FC1～FC7劃口種子各15粒，分別放入常溫水浸泡48 h（T2）及GA3 400 mg/L浸泡48 h（T5）（表1）。每組重復3次，置于25 ℃光照培養箱培養，光照16 h、黑暗8 h。

1.3.3 光照時間的影響

取FC5、FC6劃口種子15粒，常溫水浸泡48 h，置于25 ℃光照培養箱培養。光照時間設2個梯度：光照16 h、黑暗8 h（T1），全黑暗（T4）（表1），重復3次。

1.3.4 培養溫度的影響

取FC5、FC6劃口種子15粒，常溫水浸泡48 h，置于光照培養箱培養，光照 16 h、黑暗8 h。光照培養箱設置2個溫度梯度：25 ℃（T2），20 ℃（T3）（表1）。重復3次。

2 結果與分析

2.1 休眠類型鑒定

2.1.1 種殼掃描電鏡觀察

從圖1可以看出，不同樹種種殼厚度及結構不同，其中FC4種殼最厚，其次為FC6、FC7。從橫斷面圖來看，種殼結構分為3層，最外面為角質層，然后是外表皮細胞和內表皮細胞。角質層細胞石質化，形成蠟質層，非常致密，對吸水有嚴重阻礙作用。外表皮細胞呈柵欄狀排列，主要由單層長柱狀的大石細胞組成，其細胞壁厚度增加，呈木質化。外表皮細胞增加了種皮的厚度和硬度，對水分進入種子有很大的阻礙作用。內表皮細胞厚度因樹種而異，其中FC4的內表皮細胞層很厚，占據了整個種殼的大部分厚度，但排列較為疏松，其他樹種內表皮細胞相對較薄。內外表層細胞之間有1層被擠壓的薄壁組織，較薄。內表面圖顯示有很多細長管狀或帶狀的表皮毛，內表皮細胞排列不規則，內表面凹凸不平，外表面圖顯示大部分樹種種殼外表面比較規則、平整，其中FC5、FC7表面非常光滑，其他樹種表面有空隙，這對種子的吸水性也有一定影響。

2.1.2 種殼吸水性

青岡屬種子本身屬于含水量較高的種子。從圖2可以看出，對于所有樹種，去殼種子和劃口種子的最終吸水率均明顯高于完整種子。完整種子吸水率最終達到5%左右，而去殼種子和劃口種子大部分在10%左右，有的甚至超過20%。前8 h為快速吸水期，吸水率迅速上升，8 h后吸水率逐漸下降，最后趨于平緩。去殼種子可吸水時間最長，吸水率達到穩定的時間最晚。FC1、FC3、FC5、FC7的去殼種子和劃口種子最終吸水率差異不明顯，但均明顯高于完整種子。FC2、FC4、FC6的去殼種子、劃口種子和完整種子之間均差異明顯，且去殼種子最終吸水率明顯高于其他2個處理?？梢姺N殼對種子吸水存在一定的阻礙作用。

2.1.3 內源抑制物對白菜種子萌發影響 從表2可以看出，蒸餾水培養24 h后，白菜種子萌發率可達到100%，48 h后根長為20～25 mm，并長出葉片。經7個樹種的種殼和子葉浸提液培養的白菜種子，除FC2、FC3、FC4種殼以及FC4、FC5子葉處理后的萌發率較高外，其他24 h萌發率均在80%及以下。其中FC6的種殼和子葉、FC7的種殼浸提液培養24 h后，萌發率為0，48 h后萌發率仍低于80%。培養72 h后，對照根長增加至40～50 mm，葉片明顯增大，其他處理根長均無顯著增加，且有幾組處理出現根尖發黑、干枯的現象。經種殼和子葉浸提液培養后的白菜籽，僅有部分萌發出葉片，即使有葉片萌發，大部分根的長度也明顯短于對照，根的生長狀態也明顯比對照差。由此可見，浸提液對白菜種子根的伸長有抑制作用，7個樹種種殼及子葉內可能含有抑制種子萌發物質。不同樹種種殼和子葉的抑制作用程度不同。FC1種殼和子葉浸提液培養的白菜種子萌發率一致，FC2和FC3子葉浸提液培養的白菜種子萌發率小于種殼，FC4、FC5、FC6和FC7種殼浸提液培養的白菜種子萌發率小于子葉。除FC2和FC6外，其他樹種子葉浸提液培養的白菜種子72 h后根長均小于種殼，葉片生長情況也比種殼浸提液培養的白菜種子差。

2.2 休眠打破

從圖3、表3可以看出，大部分樹種在T5、T6處理條件下萌發最早，一般比對照早15～20 d。除FC7外，其他樹種在T6處理下最終發芽率均達80%以上，且FC1、FC2和FC4最終發芽率均為100%。FC1～FC5在T6處理下，發芽勢均在30%以上，其中 FC2～FC4發芽勢均高達53.33%。FC2、FC3、FC7等3個樹種在T6處理下發芽最早，培養4 d后即開始發芽，其中FC3在T5處理下，僅8 d即全部萌發。FC5、FC6在大部分處理條件下種子萌發持續時間較長。

2.2.1 光照對解除青岡種子休眠的影響

從FC5的T2、T3處理試驗結果可以看出，二者發芽勢一致，均為20%。全黑暗條件下發芽較晚，但持續時間短，最終發芽率較低;而光照16 h條件下發芽較早，但持續時間長，最終發芽率較高。從FC6的T2、T3處理試驗結果可以看出，二者發芽勢都比較低，但T3處理下發芽時間明顯早于T2處理，但最終發芽率明顯低于T2處理。從這2個樹種來看，光照時間16 h相較于全黑暗條件可以促進種子萌發。

2.2.2 培養溫度對解除青岡種子休眠的影響

從FC5的T1、T2處理試驗結果可以看出，二者最終發芽率一致，但與20 ℃相比，25 ℃條件下種子萌發更早，發芽勢略低。從FC6的T1、T2處理試驗結果可以看出，25 ℃條件下種子發芽明顯早于20 ℃，二者的發芽勢一致，但發芽率差異明顯。從這2個樹種來看，25 ℃ 相較于20 ℃，種子發芽更早，發芽率更高。因此25 ℃條件下更有利于休眠解除。

2.2.3 種子處理方式對解除青岡種子休眠的影響

對比T0、T1和T5處理可以發現，在7個樹種中有5個樹種在T5處理下最終發芽率均最高，有6個樹種在T5處理下發芽均最早。而且FC2在T5處理下，種子在發芽后5 d時間內發芽率達到100%，FC3在T5處理下，種子在開始發芽后7 d時間內發芽率達到100%，發芽速度快。T0處理下發芽最晚，發芽周期一般也最長，發芽率除FC4外均是最低的。因此，相較于劃口種子和完整種子，去種殼處理對休眠打破、提高發芽勢和發芽率有極大的促進作用。

2.2.4 激素對解除青岡種子休眠的影響

2.2.4.1 劃口種子 對于劃口種子，對比所有樹種T1和T4處理，除FC7外，使用400 mg/L GA3浸泡與使用常溫水浸泡2種處理條件下種子開始萌發時間差異不大。除FC7外，其他樹種在2種處理下的發芽勢差異也不顯著 ，但除了FC2和FC3外，其他樹種在2種處理下的最終發芽率差異顯著。因此對于劃口種子，400 mg/L GA3對最終發芽率影響較大，但對種子開始萌發時間和種子發芽勢影響不明顯。

2.2.4.2 去殼種子 對比所有樹種T5和T6處理可知，使用400 mg/L GA3浸泡與使用常溫水浸泡對種子休眠解除和發芽率差異不明顯，2種條件下種子開始萌發時間除了FC6外，其他樹種差異均不大，發芽率除了FC5外，其他樹種差異均不大。FC1、FC4、FC5等3個樹種在T6處理下的發芽勢均明顯高于T5處理，且發芽周期也明顯短于T5處理。

3 討論與結論

大多種子休眠都是由多種原因造成的[1]，可能是種皮結構致密或柵欄組織發達，也可能是種子表面角質層較厚或上覆蠟質[10-12]。周健等通過對種皮、胚乳細胞結構的觀察和分析，發現阻礙種子吸水的主要原因是發達的柵欄層，揭示了大花四照花種子的休眠解除機制[13]。本研究中7種青岡屬種子表面均有角質層，角質層細胞排列緊密，有保護種胚的作用[14]。然而表面蠟質和致密的角質層等種殼構造導致青岡屬種子的吸水性很差，本研究也證明了去掉種殼后可以增加種子吸水速率，延長種子吸水飽和狀態的時間。角質層里面是細胞緊密排列、細胞壁較厚的柵欄組織層，增加了種皮硬度。因此，角質層和柵欄組織層極有可能對胚的萌發有機械阻礙作用，影響胚根的萌發和伸長，同時也影響吸水性 這是種胚無法突破種皮進行正常萌發的原因之一。內表皮細胞排列相對疏松，可使水分迅速穿過，但有的樹種內表皮細胞厚度也很大，在一定程度上也會阻礙種子萌發。青岡屬種子結構中，種臍位置種殼最薄，且沒有堅硬的角質層，應該是整個種子透水透氣性最好的位置。但由于此次研究的7種植物胚芽均在種臍端相反位置，因而并未專門對種臍的吸水性進行研究。

植物體內產生抑制發芽物質或存在與抑制發芽相關的物質，此類物質對同種或異種種子萌發具有延遲或抑制作用[15]。朱銘瑋等認為，酚類物質是鳳丹種皮內的主要抑制物成分，有機酸類物質是鳳丹種胚內的主要抑制物質成分[16]。櫟類植物為防止昆蟲捕食種子，產生了多酚（polyphenols）[17] 和單寧酸[18]等抑制種子萌發的次生代謝物。也有研究稱櫟屬植物種子各部分甲醇浸提液都對白菜種子萌發、根長、苗高具有較強的抑制作用，其種皮、子葉、胚的浸提液對白菜種子的萌發抑制作用依次增強，而且對白菜種子萌發率的影響低于對根長、苗高的影響[19]。這與本研究的結果基本一致。本研究對子葉和種殼浸提液進行了對比，大部分樹種子葉對白菜種子的抑制作用要比種殼強，且對根的伸長和葉片萌發的抑制作用要強于對發芽率的作用。說明青岡屬種子中確實含有抑制白菜種子萌發的物質。但是試驗中浸提液濃度很高，若進行稀釋，是否還對白菜種子萌發有抑制作用，這些并未進行詳細研究。而且自然界中的種子各部分中抑制物質的含量以及該含量是否可以抑制青岡種子萌發，也都需要進一步試驗論證。

景美清等認為，內果皮、種皮的機械阻力和透氣性是影響赤皮青岡種子休眠的主要原因，去除了內果皮、種皮后即可打破休眠。高濃度的GA3處理也有一定的作用[20]。本研究對比了光照時間、培養溫度、種殼處理方式及激素等因素對休眠打破的影響，發現種殼機械處理對種子萌發影響最大，其他因素也有一定影響。本試驗未對胚的形態進行研究，不能從形態結構上確定胚是否存在生理后熟。但種子在劃口和去殼后迅速萌發，去殼后效果尤為明顯，從側面驗證了胚不存在生理后熟，種殼對胚的機械阻礙是導致休眠的主要原因。

參考文獻：

[1]郭聰聰，沈永寶，史鋒厚. 白皮松種子休眠研究進展[J]. 南京林業大學學報（自然科學版），2019，43（2）：175-183.

[2]Nikolaeva M G. Factors controlling the seed dormancy pattern[M]//Khan A A. The physiology and biochemistry of seed dormancy and germination. Amsterdam：North-Holland Publication Co.，1997.

[3]Baskin C C，Baskin J M. Seeds：Ecology，biogeography and evolution of dormancy and germination[M]. 2nd ed. San Diego：Academic Press，2014.

[4]孟慶偉，高輝遠. 植物生理學[M]. 北京：中國農業出版社，2011：317-318.

[5]耿文娟，馮貝貝，梅 軒，等. 野生歐洲李種子萌發特性[J]. 經濟林研究，2017：35（1）：20-25.

[6]仇云云，崔 健，劉 雪，等. 紫斑牡丹種子休眠原因初探[J]. 浙江農林大學學報，2018，35（3）：497-504.

[7]李金華. 赤皮青岡種子萌發及幼苗生長調控技術研究[D]. 長沙：中南林業科技大學，2017.

[8]彭穎姝，李鐵華，文仕知，等. 不同沙藏處理對青岡櫟種子萌發的影響[J]. 中南林業科技大學學報，2016，36（8）：44-48.

[9]李慶梅，劉 艷，劉廣全，等. 櫟屬7種植物種子的發芽抑制物質研究[J]. 生態學報，2013，33（7）：2104-2112.

[10]周 健，蘇友誼，代 松，等. 紫荊種子成熟過程中種皮和胚乳超微結構觀察[J]. 南京林業大學學報（自然科學版），2016，40（6）：27-32.

[11]楊萬霞，洑香香，方升佐. 青錢柳種子的種皮構造及其對透水性的影響[J]. 南京林業大學學報（自然科學版），2005，29（5）：25-28.

[12]Greipsson S. Effects of stratification and GA3 on seed germination of a sand stabilising grass Leymus arenarius used in reclamation[J]. Seed Science and Technology，2001，29 （1）：1-10.

[13]周 健，代 松，錢存夢，等. 大花四照花種子休眠解除過程中種皮和胚乳結構變化[J]. 東北林業大學學報，2014，44（5）：34-38.

[14]錢領元，施拱生. 烏桕籽“蠟被”形成過程的研究[J]. 浙江林學院學報，1986，3（1）：1-5.

[15]Evenari M. Germination inhibitors[J]. The Botanical Review，1949，15（3）：153-194.

[16]朱銘瑋，鄒雨婷，李永榮，等. 油用牡丹‘鳳丹’種子內源抑制物研究[J]. 西南林業大學學報，2019，39（6）：64-70.

[17]Rakic S，Povrenovic D，Tesevic V，et al. Oak acorn，polyphenols and antioxidant activity in functional food[J]. Journal of Food Engineering，2006，74（3）：416-423.

[18]Shimada T. Nutrient compositions of acorns and horse chestnuts in relation to seed-hoarding[J]. Ecological Research，2001，16（4）：803-808.

[19]李慶梅. 幾種北方落葉櫟種子發育的形態生理及萌發特性研究[D]. 北京：北京林業大學，2013.

[20]景美清，李志輝，楊模華，等. 赤皮青岡種子質量與萌發特性研究[J]. 中國農學通報，2012，28（34）：27-30.