嘧啶酮衍生物和牛血清白蛋白的熒光光譜研究*

高曉培，陳思遠，閔夢嬌，黃毅哲，張國生，路東亮,?，黃書娟

(1.贛南師范大學 化學化工學院，江西省高等學校功能材料化學重點實驗室；2.贛南醫學院，江西 贛州 341000)

嘧啶酮屬于含氮雜環化合物，其衍生物有著抗病毒、抗癌(圖1a)、抗炎(圖1b)、抗菌等廣泛的藥理活性和生物活性[1-3]，同時嘧啶酮衍生物也是一種十分重要的藥物中間體.近幾年科學工作者對其進行了許多的研究，發現嘧啶酮衍生物更多的生物和藥理作用，某些多官能團的嘧啶酮衍生物還被用作鈣通道阻滯劑、抗高血壓劑、拮抗劑、抗氧化劑、抗腫瘤藥、抗炎和抗結核等藥物[4].由于嘧啶酮衍生物在各個方面的良好表現，近幾年已經成為含氮雜環化合物的研究熱點.

圖1 具有生物活性的嘧啶酮衍生物

在人體及動物的所有蛋白質當中，科學工作者對血清白蛋白的研究最為廣泛和清晰.血清白蛋白占血漿中所有球狀蛋白的60%，在血漿中含量十分豐富，且提供近80%的滲透壓.除此之外，血清白蛋白還可以供給營養、緩沖pH值和運輸載體等[5-6].牛血清白蛋白(BSA)與人血清蛋白(HSA)的結構和氨基酸序列非常相似，并且BSA更容易獲取，所以通常在與小分子藥物相互作用的研究中，選擇BSA作為模型蛋白.BSA中含有583個氨基酸殘基，而在本實驗中發揮主要作用的只有兩種色氨酸(Trypt-ophan，Trp)，即Trp-314和Trp-213[7].

本文在課題組前期工作的基礎上，選擇4種不同取代基的嘧啶酮衍生物，研究其與BSA的相互作用，進一步加深人們對嘧啶酮衍生物在體內的分布、轉運機制的理解，為開發嘧啶酮類新藥及研究嘧啶酮藥物對人體的作用提供一定的理論依據.同時，通過本實驗可以探究嘧啶酮骨架的結構改造和性能，并研究其對血清白蛋白的結構功能的影響.

1 實驗部分

1.1 主要儀器

渦旋混勻器(Vortex Mixer v8, 上海凌儀實業有限公司)；pH計(Sartorius Basic pH Meter PB-10,上海人和科學儀器有限公司)；真空干燥箱(DZF-6020，鄭州寶晶科技有限公司)；電子天平(CP114, 常州有限公司)；熒光發光分光光度儀光譜儀(Perkin Elmer Ls 55).

1.2 主要試劑

主要試劑：實驗室已有的d1、d2、d3、d4四種嘧啶酮衍生物，結構如圖2.

圖2 4種嘧啶酮衍生物結構

其他試劑：二甲亞砜(DMSO)(分析純)；牛血清白蛋白(BSA)(Fraction V)；處理方法為標準方法.

1.3 實驗方法

2 結果與討論

2.1 化合物猝滅BSA熒光圖

通過熒光光譜法，得到化合物d1至d4在298 K和308 K下對BSA熒光猝滅效果，分別如圖3、圖4所示(注：圖3和圖4中，BSA的熒光強度隨加入的化合物濃度增大而減小.序號1至11表示化合物濃度與BSA濃度之比為0、1、2、3、4、5、6、7、8、10及不加入BSA溶液時的熒光強度).

圖3 化合物d1至d4在298 K下對BSA熒光猝滅的圖

圖4 化合物d1至d4在308 K下對BSA熒光猝滅的圖

由圖3、圖4可知，在298 K和308 K兩種溫度下，我們發現BSA的熒光強度與化合物濃度存在關系，進一步分析發現：化合物濃度增大時，BSA的熒光強度會有規律的減弱，說明化合物分子與BSA之間的確存在著相互作用.對比d1-d4在10倍于BSA的濃度下，我們發現在308 K溫度時對BSA熒光猝滅效果比其在298 K時的效果更好，對比化合物d1-d4發現，化合物d1對熒光的猝滅效果優于其他3個化合物，而化合物d3對熒光的猝滅效果最弱.

2.2 化合物與BSA作用機制的研究

通過stern-volmer方程，可以計算出化合物d1至d4在298 K和308 K下與BSA作用的Ksv(Stern-Volmer猝滅常數)，以化合物濃度Q為橫坐標， F0/F為縱坐標(F和F0分別為有/沒有猝滅劑存在時的熒光強度)，得到的標準曲線圖如下所示(圖5).

圖5 化合物d1-d4在298 K和308 K的stern-volmer方程標準曲線圖

通過stern-volmer方程和Ksv=KQ×τ0公式計算可得到化合物d1至d4猝滅BSA熒光的Ksv值與速率常數KQ，如表1所示：

表1 化合物d1-d4猝滅BSA熒光的Ksv值和速率常數KQ

由圖表1得知，化合物d1至d4在298 K及308 K 2種溫度下猝滅BSA熒光的速率常數KQ在數值上遠大于2×1010L/mol·s.故化合物d1至d4在兩個溫度下猝滅BSA熒光的猝滅類型是靜態猝滅，即化合物與BSA間形成了復合物，從而導致BSA的熒光猝滅[8].針對靜態猝滅，我們使用方程lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlgQ可以求出d1至d4在298 K和308 K下與BSA的結合常數Ka和結合位點數n.通過畫圖，以lgQ為橫坐標，lg(F0-F)/F為縱坐標，得到的標準曲線如圖所示(圖6).

圖6 化合物d1至d4在298 K、308 K下與BSA結合的方程圖

化合物d1至d4在298 K和308 K與BSA的結合常數的對數lgKa和結合位點數n如表2所示.

表2 化合物d1至d4與BSA的結合常數和結合位點數

分析表2可知，化合物d1至d4與BSA的結合常數Ka幾乎都大于105，與BSA的結合位點數n約為1，由此可知化合物d1至d4均與BSA有著相當好的結合能力[9].

利用van't Hoff公式和熱力學公式可計算出化合物d1至d4在298 K與308 K下和BSA作用的熱力學常數，如表3所示.

表3 化合物d1至d4猝滅BSA的熱力學常數

由表3可知，化合物d1至d4與BSA結合的熱力學常數△G<0，故化合物與BSA的結合過程是自發進行.表中還顯示部分反應的△H>0，部分反應△H<0，可知雜合體藥物與BSA作用有些是吸熱反應，有些是放熱反應，但放熱反應和吸熱反應與藥物分子的結構間無特殊規律，其絕對值與分子結構間也無特殊規律.有部分藥物分子與BSA作用的△S>0，另一部分△S<0，可知熵減反應和熵增反應與藥物分子的結構和取代基的類型間無特殊規律，且絕對值大小與分子的結構和取代基的類型間也無特殊關系.

3 總結

本文通過熒光光譜法分別對4種嘧啶酮衍生物與BSA的相互作用進行了研究.對熒光光譜圖進行數據分析，結果表明：實驗研究的4種嘧啶酮衍生物都能使BSA猝滅，猝滅類型為靜態猝滅，并且嘧啶酮衍生物與BSA都有著很好的結合能力，結合位點數約為 1，△G值小于0，說明化合物與BSA的結合是自發的.其中△S和△ H 大于 0,說明化合物 d1,d4與BSA結合以疏水作用力占主導；△S和△H小于0，說明化合物d2,d3與BSA結合以氫鍵或范德華作用力占主導.