甜橙ERF B3亞組轉錄因子的鑒定和表達分析*

李 玲，劉新軍，張保蓮，張斯羽，歐陽智剛，?

(1. 贛南師范大學 生命科學學院；2. 國家臍橙工程技術研究中心，江西 贛州 341000)

植物在生長發育過程中一直遭受干旱、高鹽、低溫及病蟲害等各種生物和非生物脅迫的影響[1].在長期的協同進化中，植物形成了一個復雜、有效的信號傳導網絡，以抵抗外界不利環境[2].轉錄因子作為反式作用元件，通過與靶標基因上游的順式作用元件特異性結合來調節基因表達，以轉錄水平的調控方式來精確地應答脅迫反應[3].近年來研究顯示AP2/ERF(APETALA 2/ethylene-responsive element bindingfactor)、bZIP(Basic-domain leucine-zipper)、WRKY、MYB、NAC(NAM、ATAF1/2 和CUC2)、bHLH(Basic helix-loop-helix)、NF-Y(Nuclear Factor Y)和CAMTA (CaM-binding transcription activator)等轉錄因子參與了調控植物多種逆境脅迫反應[4-11].其中AP2/ERF轉錄因子是最大的家族之一.

AP2/ERF轉錄因子編碼的蛋白含有高度保守的AP2結構域.AP2結構域包含58個或59個氨基酸，與靶標DNA序列具有高親和力.根據AP2結構域的數量和特征，AP2/ERF家族可分為四個亞家族，包括AP2(APETALA2)、RAV(related to ABI3/VP1)、REB(脫水反應性元素結合蛋白, dehydration-responsive element binding protein)和ERF(乙烯反應因子, ethylene-responsive factor)[12].AP2家族含2個AP2/EREBP結構域，ERF和DREB家族僅含1個AP2/EREBP結構域，這兩個家族均又進一步細分為6或7個亞組 (A1-A6;B1-B6或-B7).RAV家族除含有一個AP2/EREBP結構域外，還包含1個B3結構域[13-14].ERF家族是AP2/ERF轉錄因子大家族中的一個主要亞家族，ERF蛋白可以與許多乙烯調節的防御基因啟動子區域GCC框(AGCCGCC)的順式元件特異性結合，起轉錄激活因子或阻遏物的作用[15].ERF轉錄因子廣泛分布于植物中，Nakano等(2006)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)基因組中分別鑒定了65和77個ERF轉錄因子[16-17].最近幾年隨著多種植物基因組測序完成，相繼在鳳梨(Ananascomosus)、芹菜(Apiumgraveolens)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、甘藍型油菜(Brassicanapus)、棉花(Gosssypiumraimondii)、蘋果(Malus×domestica)、甘蔗(Saccharumspontaneum)、番茄(Solanumlycopersicum)、綠豆(Vignaradiata)、葡萄(Vitisvinifera)和玉米(Zeamays)等中篩選和鑒定了ERF轉錄因子[18-28].

ERF亞家族不同亞組中的成員具有不同的功能.研究表明ERF B3亞組轉錄因子在植物防御病菌的反應中發揮重要作用.本文根據ERF B3亞組轉錄因子的結構特點，在甜橙基因組數據庫中篩選和鑒定了21個ERF B3亞組轉錄因子，進一步分析了甜橙ERF B3亞組轉錄因子受黃龍病菌和外源激素的誘導表達情況.同時研究了甜橙ERF B3亞組轉錄因子的亞細胞定位及轉錄激活活性.本文的研究可以為甜橙ERF B3亞組轉錄因子的功能分析提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料和前處理

本試驗所用柑橘材料為贛南早(CitrussinensisOsbeck cv. Gannanzao)幼苗，均由贛南師范大學國家臍橙工程與技術研究中心提供.激素誘導處理：分別用1 mM SA，100 μMJA，100 μM ABA噴霧處理贛南早幼苗，對照為等量噴無菌水，恒溫保濕培養[29].分別于0 h、24 h和48 h后采集樣品葉片，-80 ℃下保存.

1.2 植物葉片總RNA提取

將植物葉片置于液氮中磨碎，每0.5 g葉片加入1 mL Trizol，震蕩混勻，并室溫放置5 min，4 ℃ 10 000 g離心10 min，取上清，每使用1 mL Trizol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，于室溫放置5 min.4 ℃ 10 000 g離心10 min，取上清，重復加入0.2 mL和0.5 mL氯仿萃取2次.離心后把水相轉移到新管中，等體積加入異丙醇，于室溫放置10 min.4 ℃ 10 000 g離心10 min，棄上清.用75%乙醇洗滌RNA沉淀.每使用1 mL Trizol至少加1 mL 75%乙醇.4 ℃不超過5 000 g離心5 min，棄上清.室溫放置干燥5 min，再加入20 μL～30 μL無RNase的水溶解RNA，置于-80 ℃下保存.

1.3 柑橘ERF B3亞組轉錄因子的系統篩選

從柑橘基因組數據庫(https://www.citrusgenomedb.org/)下載甜橙全基因組1.0(ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/www.citrusgenomedb.org/Citrus_sinensis/C.sinensis_Hzau_v1.0_genome/annotation/)蛋白組數據. 利用HMMER 3.1b2軟件包中的hmmbuild程序對ERF結構域種子序列(PF04404)建立隱馬爾可夫模型，利用hmmsearch程序在甜橙蛋白組數據中進行搜索(E-value<10-3)，獲得含ERF結構域蛋白. 將挖掘出的所有含ERF結構域蛋白和已報道的893條真核及原核生物中的含ERF結構域蛋白序列一起利用hmmalign程序基于PF04404的隱馬爾可夫模型進行多重序列比對，得到比對序列. 利用MEGA7軟件打開比對文件，并人工調整. 利用Smart model selection軟件對比對序列最適的最大似然法建樹模型進行檢測. 根據最適建樹模型，利用PhyML3.0對比對文件建立系統發生關系，利用外群法確定樹根. 系統發生樹上，與植物含ERF結構域序列形成單系群的甜橙含ERF結構域序列為甜橙的ERF B3亞組轉錄因子.

1.4 甜橙ERF B3亞組轉錄因子亞細胞定位

以甜橙cDNA為模板，根據數據庫序列設計引物，特異性擴增目的基因全長序列(引物見附表1)，將PCR產物插入瞬時表達載體pGR106中，分別命名為pGR106:CsERF B3-9/10/13/20/21并轉入農桿菌GV3101中. 將攜帶pGR106:CsERF B3-9/10/13/20/21的農桿菌在含有50 mg/L卡那霉素(Kan)、50 mg/L氯霉素(Chol)和25 mg/L慶大霉素(Gen)的YEP平板上劃線，放置于28 ℃恒溫培養箱內培養2 d，并采用菌落PCR驗證轉化結果. 按1:50～1:100的比例接種于10 mL含相同抗生素的YEP中，28 ℃、220 rpm培養8 h～12 h擴大培養至OD600=0.8～1.2，4 000 rpm，4 ℃離心10 min收集菌體，棄上清，用含有乙酰丁香酮(50 mmol/L, AS)的侵染液(1 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L MES, pH 5.6)懸浮菌體，使其OD600=1.0～1.5，室溫放置3 h后，以攜帶pGR106:GFP載體的GV3101為陰性對照，用不帶針頭的1 mL針管抵住煙草葉片的背面，注入葉片，48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白定位.

1.5 甜橙ERF B3亞組轉錄因子的轉錄活性分析

以甜橙cDNA為模板，根據數據庫序列設計CsERFB3-9/10/13/20/21引物特異性PCR擴增其全長序列(引物見附表1)，將PCR產物酶切插入載體pGBKT7中.將重組質粒和pGBKT7空白載體分別轉入酵母菌株YRG-2中.酵母轉化方法：用YPDA固體培養基(10 g/L Yeast extract,20 g/L Tpyptone,20 g/L Agar,2% dextrose glucose)培養酵母菌株2 d～3 d后，刮取25 μL酵母菌落懸于1 mL ddH2O中，高速離心5 s后，用1 mL 100 mM LiAc懸浮沉淀；30 ℃水浴中溫育5 min，高速離心5 s，棄上清；在沉淀物中按順序分別加入以下液體：240 μL PEG(50% w/v,重量/體積)，36 μL LiAc(1.0 M)、50 μL ssDNA(2.0 mg/mL)、5 μL plasmid DNA(100 ng至5 μg)、20 μL ddH2O；渦旋1 min，42 ℃溫育40 min后；12 000 rpm離心10 s，棄去上清，用200 μL～400 μL ddH2O 重懸沉淀，取適量涂于SD/-Trp培養基上，30 ℃培養2 d.挑單菌落分別劃線于SD/-Trp/-His培養基上，2 d后觀察轉錄因子活性結果.

1.6 RT-qPCR

按SuperScript III Kit(Invitrogen, 中國上海)方法對提取的RNA進行反轉錄合成cDNA.根據數據庫中的ERF B3亞組轉錄因子的序列設計RT-qPCR特異性引物(引物見附表1)，以基因CitEF1作為內參.每個RT-qPCR反應體系包含12.5 μL SYBR? Premix Ex TaqTM、1 μL正反向引物(10 μmol/L)、1 μL cDNA模板和9.5 μL RNAse-free水.反應程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，34個循環.

圖1 甜橙(C. sinensis)、擬南芥(A. thaliana)、番茄(S. lycopersicum)、甘蔗(S. spontaneum)、玉米(Z. mays ssp)和葡萄(V. vinifera)ERF B3亞組轉錄因子氨基酸序列系統進化樹

2 試驗結果

2.1 甜橙ERF B3亞組轉錄因子系統進化分析

本文在柑橘數據庫中篩選和鑒定了21個甜橙ERF B3亞組轉錄因子. 根據染色體上的位置，我們將其分別命名為CsERFB3-1～21(對應的Gene ID分別為：Cs1g03250_1、Cs1g03260_1、Cs1g03270_1、Cs1g03280_1、Cs1g03290_1、Cs1g03300_1、Cs1g03310_1、Cs2g05270_1、Cs2g05280_1、Cs5g08360_1、Cs5g23980_1、Cs5g24010_1、Cs5g29870_1、Cs5g29880_1、Cs5g29890_1、Cs5g29900_1、Cs8g12780_1、Cs9g10680_1、Cs9g13610_1、Cs9g13620_1、Cs9g13630_1).將CsERF B3亞組轉錄因子蛋白序列與擬南芥、甘蔗、番茄、玉米和葡萄共149個ERF B3亞組轉錄因子蛋白序列構建親緣關系進化樹(如圖1所示).ERF B3亞組轉錄因子被分為4組，其中第1組中包括12個甜橙、4個擬南芥、5個甘蔗、12個番茄、5個玉米和6個葡萄ERF B3亞組轉錄因子；第2組包括1個甜橙、1個甘蔗、1個番茄、1個玉米和1個葡萄ERF B3亞組轉錄因子；第3組分別包括4個甜橙、10個擬南芥、5個甘蔗、11個番茄、2個玉米和20個葡萄ERF B3亞組轉錄因子；第4組4個甜橙、3個擬南芥、5個番茄、12個甘蔗、10個玉米和14個葡萄ERF B3亞組轉錄因子.此外我們發現幾個甜橙ERF B3亞組轉錄因子與番茄已報道的具有抗病功能的轉錄因子聚類關系比較近，比如CsERFB3-10和番茄SlERF.A1、CsERFB3-17和番茄SlERF.C3、CsERFB3-19與CsERFB3-20和SlERF.B4、CsERFB3-21和SlERF.A4以及CsERFB3-13和擬南芥AtERF93/94等.

圖2 甜橙ERF B3亞組轉錄因子在不同組織中的表達分析

2.2 甜橙ERF B3亞組轉錄因子在不同組織中的表達特征

我們在柑橘基因組數據庫(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)中下載甜橙ERF B3亞組轉錄因子在愈傷組織、花、葉和果實中的表達數據進行分析，發現甜橙ERF B3亞組轉錄因子在不同組織中的表達模式不一樣(如圖2所示.Callus：愈傷組織；Flower：花；Leaf：葉；Fruit：果實).CsERFB3-3/7/8/11/12/14/15/16/17/18在愈傷組織、花、葉和果實這四個組織中表達均很低.在其余的CsERF B3亞組轉錄因子中，除了CsERFB3-19之外，其他CsERF B3亞組轉錄因子均在果實中表達最高，葉片中的表達量次之.

2.3 甜橙ERF B3亞組轉錄因子在感染黃龍病不同柑橘品種的表達特征

甜橙ERF B3亞組轉錄因子對黃龍病菌有著不同的響應，相同基因在不同的品種中也存在差異表達.我們根據不同品種感染黃龍病的轉錄組數據[30]，分析了柑橘ERF B3亞組轉錄因子在道縣野橘(C.daoxianensis)、宜昌橙(C.ichangensis)和甜橙中應答黃龍病侵染的表達特征(如圖3所示.FPKM.CD-HLB：道縣野橘黃龍病患病植株FPKM值；FPKM.CD-MOCK：健康道縣野橘FPKM值；FPKM.CI-HLB：宜昌橙黃龍病患病植株FPKM值；FPKM.CD-MOCK：健康宜昌橙FPKM值；FPKM.CS_HLB：甜橙黃龍病患病植株FPKM值；FPKM.CD_MOCK：健康甜橙FPKM值).

圖3 甜橙ERF B3亞組轉錄因子受HLB病原菌誘導的表達分析

該轉錄組數據顯示，CsERFB3-1/2/3/7/8/11/12/14/15/16/17/18這12個基因的表達豐度在3個品種中表達都非常低，FPKM (Fragments Per Kilobase Million)值大部分為0或接近于0，這與柑橘基因組數據庫中的表達情況相似(圖2).在道縣野橘中，CsERFB3-2/5/6/21這四個基因在感染黃龍病后上調表達顯著，相反CsERFB3-10和CsERFB3-13兩個基因下調表達顯著；在宜昌橙中，CsERFB3-5和B3-6兩個基因是上調表達，CsERFB3-19/20/21為下調表達；在甜橙中，CsERFB3-5/6/9/19/20/21六個基因顯著上調表達，只有CsERFB3-1一個基因下調表達.同時還發現CsERFB3-5和B3-6這兩個基因在3個品種中均呈上調表達，但CsERFB3-21在道縣野橘和甜橙中上調表達顯著，而在宜昌橙中則為下調表達顯著.

2.4 激素誘導ERF B3亞組轉錄因子的表達特征

根據柑橘感染黃龍病菌的轉錄組數據，我們挑選了表達相對較高的CsERF B3亞組轉錄因子(CsERFB3-4/5/6/9/10/13/19/20/21)進行外源激素誘導表達分析(如圖4所示).通過熒光定量PCR技術分析激素處理后甜橙ERF B3亞組轉錄因子表達情況，結果顯示CsERFB3-9/10/13/20/21基因在12 h和24 h兩個時間點受SA誘導上調表達顯著，而CsERFB3-4顯著下調表達.受JA誘導12 h或/和24 h后CsERFB3-10/13/20/21四個基因顯著上調表達，同樣CsERFB3-4基因下調表達顯著.ABA誘導對CsERF B3亞組轉錄因子的表達影響較小，只有在24 h時，CsERFB3-4和CsERFB3-21分別下調和上調表達顯著.另外CsERFB3-5/6/19這三個基因在3種激素誘導下表達均無差異.

圖4 甜橙ERF B3亞組轉錄因子受激素誘導的表達分析

2.5 甜橙ERF B3亞組轉錄因子亞細胞定位

為了明確甜橙ERF B3亞組轉錄因子的亞細胞定位，根據ERF B3亞組轉錄因子應答黃龍病病原菌的表達情況，我們挑選了CsERFB3-9/10/13/20/21五個轉錄因子進行亞細胞定位研究.結果顯示：在對照組中，本氏煙細胞核和細胞膜上均可觀察到GFP信號，而CsERF B3-9/10/13/20/21-GFP融合蛋白則只定位在細胞核上(如圖5所示)，表明CsERF B3-9/10/13/20/21-GFP為核定位蛋白.

圖5 甜橙ERF B3亞組轉錄因子亞細胞定位

圖6 甜橙ERF B3亞組轉錄因子 轉錄激活活性檢測

2.6 甜橙ERF B3亞組轉錄因子轉錄活性分析

在攜帶對照載體pGBKT7的酵母細胞中，載體上酵母轉錄激活因子GAL4 DNA結合域(DNA binding domain, BD)可以和上游激活序列結合，但不能引起報告基因LacZ轉錄.如將一段具有轉錄激活活性的轉錄因子構建到pGBKT7載體上，其表達產生的BD與上游激活序列結合，同時引起下游報告基因LacZ的轉錄，進而水解培養基上的x-α-Gal，使菌落產生藍斑.利用這一原理，我們對CsERFB3-9/10/13/20/21進行了轉錄活性驗證.結果表明(如圖6所示)，攜帶pGBKT7:CsERF B3-9/10/13/20/21的酵母均能在雙缺培養基SD/-Trp/-His上正常生長，并且雙缺培養基中加入x-α-gal 后顯示藍色反應，說明CsERFB3-9/10/13/20/21均具有轉錄激活活性.

3 討論

ERF轉錄因子是植物AP2/ERF轉錄因子家族中最大的亞家族之一，根據其結構特點又進一步分為6～7個亞組(B1～B7)不等，比如在擬南芥、水稻、番茄、葡萄和玉米等植物中分為6個亞組[16-17,25,27-28]，而在二穗短柄草和棉花等植物中則分為7個亞組[20,22].在ERF亞家族中，ERF B3亞組成員相對較多.比如在小麥中有22個，在擬南芥中有18個，葡萄有37個[16,27-28].本文在柑橘基因組數據庫中篩選鑒定了21個ERF B3亞組成員.我們進一步對植物ERF B3亞組轉錄因子進行了聚類分析，發現甜橙ERF B3亞組轉錄因子與番茄和擬南芥中已報道的具有抗病功能的轉錄因子聚類關系比較近，比如CsERFB3-10和番茄SlERF.A1、CsERFB3-17和番茄SlERF.C3、CsERFB3-19與CsERFB3-20和SlERF.B4、CsERFB3-21和SlERF.A4以及CsERFB3-13和擬南芥AtERF93/94等.聚類關系較近的基因在功能上具有相似性，我們推測與報道的具有抗病功能的轉錄因子聚類關系較近的甜橙CsERF B3亞組轉錄因子可能在抗病反應中也發揮作用.

植物ERF蛋白可以作為轉錄激活物或抑制因子發揮作用[31].順式作用元件GCC盒是ERF轉錄因子的主要靶位點，ERF轉錄因子能結合啟動子中GCC盒調控靶標基因的表達.研究表明擬南芥AtERF15(AtERF93)、TERF1、番茄SlERF.A1、SlERF.B4和SlERF.C3在酵母細胞中均具有轉錄激活活性[29,32-33].此外擬南芥ERF1和ORA59可以和JA/ET響應的病原相關基因PDF1.2和b-CHI上的CGG box結合來誘導其表達[34-35].本文中，CsERFB3-9/10/13/20/21等5個甜橙ERF B3亞組轉錄因子也均有轉錄激活作用，并且位于細胞核內，因此我們推測該5個甜橙ERF B3亞組轉錄因子也具有誘導含有CGG box基因表達的能力.

植物激素水楊酸、茉莉酸和乙烯在抗生物脅迫信號轉導途徑的調節中起主要作用.這種調節是通過連接不同途徑的復雜調節網絡來實現的，從而使每個途徑根據需要協助或拮抗其他途徑來微調對單個病原體的防御反應.一般認為SA在激活對活體營養性病原菌的防御中起主要作用，而JA和ET則對壞死性病原菌攻擊的防御相關，此外SA抗病信號途徑和JA/ET抗病信號途徑間存在相互拮抗的關系.比如SA可以通過下調ORA59的表達擬制JA應答相關基因的表達.EFR B3亞組轉錄因子能通過依賴SA和/或JA途徑激活植物對病原菌的抵抗力.研究表明GbERFb、GmERF113、擬南芥ERF1(AtERF92)、AtERF15(AtERF93)、ORA59(AtERF94)、ATERF14(AtERF97)、NbERF173、番茄SlERF.A1、SlERF.B4、SlERF.C3、ZmERF105、小麥TaERF3和TaAP2-155等EFR B3亞組轉錄因子參與了植物對病原菌的防御反應[29,33,35-36].反過來ERF B3亞組轉錄因子受病原菌誘導存在差異表達，例如SlERF.A1、SlERF.B4和SlERF.C3受病原菌的誘導上調表達顯著[29].本文CsERFB3-9/10/13/20/21被SA和/或JA誘導表達，同時也受黃龍病菌的誘導上調表達顯著.我們推測這5個ERF B3亞組轉錄因子可能通過依賴SA和JA信號傳導途徑正調控甜橙對黃龍病菌的抗性反應.然而要證明這些推測，還需要通過進一步的實驗驗證，比如通過過表達或基因沉默來驗證基因功能.