乳制品等食品中維生素A和E含量測定方法研究進展

范芳芳，鄒 力，魏寧果，安 瑜

陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安 710048

0 引言

維生素A（Vitamin A，VA）和E（Vitamin E，VE）是人和動物維持正常的生理功能而必需的微量有機物質，具有促進骨骼生長、維持視力發育、促代謝以及抗衰老的重要作用[1]。維生素A的活性形式包括視黃醇、視黃醛和視黃酸3 種衍生物，其中視黃醇是VA主要的天然存在形式，主要存在于動物體內[2]。VE又稱生育酚，目前發現的主要包括α-T，β-T，γ-T，δ-T 4 種生育酚和α-TT，β-TT，γ-TT，δ-TT 4種生育三烯酚[3]。由于VA和VE結構復雜，異構體較多，準確測量比較困難。國內外學者致力于VA和VE的檢測研究較多，目前主要有微生物法法、光譜分析法、色譜質譜分析法、加壓毛細管電色譜法、電化學分析法等[4]。本文主要綜述了電化學分析法、分光光度法、液相色譜（串聯質譜）法以及氣相色譜（串聯質譜）等檢測方法的操作過程以及結果研究，對比分析了各種方法優缺點，為提升VA和VE的檢測標準提供參考。

1 電化學法

電化學法是利用待測物質在電極表面發生氧化還原反應而引起的電位變化，從而實現對待測物質的定性或定量檢測[5]。有研究以甲苯和乙醇的混合溶液為提取溶劑，采用計時電位滴定法，測定了4 種植物油中的VE，該法最低檢出限為15 mg/dm3[6]。尹淑濤等[7]采用恒電位聚合的方法，快速檢測植物油中的VE，該法相關系數（R2）為0.9963，最低檢出限為2×10-6mol/L（S/N＝3）。電化學方法具有靈敏度高、設備成本低、操作簡單、易于自動化等優點，適用于食品快檢。開發新的電極材料，同時實現VA和VE在乳制品等食品中的快速檢測是今后的發展趨勢。

2 分光光度法

分光光度法是通過測定目標物質在特定波長處或一定波長范圍內的吸光度，對該物質進行定性定量的分析方法，在食品檢測領域有著非常重要的應用[8]。李湘玲等[9]采用分光光度法測定維生素E丸中的VE含量，該法測得回收率為99.71%~100.21之間，變異系數為0.24%（n＝5）。劉樹恒[10]在表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨的存在下利用VE將Fe3＋還原為Fe2＋，以5-硝基-1，10-菲咯啉為顯色劑采用分光光度法間接測定VE，該法相關系數0.9993，VE的含量在0.3~2.0 mg/L范圍內，符合比耳定律，該法檢測結果與《中國藥典》中VE的檢測方法所得結果一致。分光光度法與統計學方法（正交法、最小二乘法等）聯用，以及分光光度計與其他檢測儀器聯用，都可以使其應用范圍進一步擴大。

3 氣相色譜（串聯質譜）法

在液相色譜技術發展起來以前，脂溶性維生素多采用氣相色譜（串聯質譜）法進行分析檢測。氣相色譜（串聯質譜）法是以氣體為流動相的色層分離分析方法，該法在乳制品等食品中VA和VE的檢測應用如表1。

表1 氣相色譜（串聯質譜）法在食品中VA和VE的檢測應用

氣相色譜法測定VE所用色譜柱從填充柱到毛細管柱再到表面修飾或者化學改性的色譜柱[15]，具有靈敏度高，干擾小、分離度高、檢出限低等優點。由于氣相色譜法流動相為氣體，升溫溫度過高，對熱不穩定性VA檢測結果不準確，雖說氣相色譜-三重四極桿質譜法能夠解決這一問題，但是儀器設備昂貴，實驗室檢測不便于普遍推廣。

4 液相色譜法

液相色譜法是以液體為流動相的色譜分析方法，基本原理是基于固定相對目標物和雜質的吸附能力不同而分離，并定量檢測。我國的國標方法和國際歐盟的方法均采用液相色譜法，因此該法是乳制品等食品中VA和VE檢測的主流方法，也是被各位學者研究最多的方法之一。液相色譜法又分為反相液相色譜和正向液相色譜。

4.1 反向液相色譜

反向液相色譜在乳制品中VA和VE的檢測應用主要是以GB5009.82—2016[16]第一法為代表，包括皂化、液液提取、洗滌、濃縮等步驟。該法操作步驟繁瑣、使用有機試劑較多、重現性較差，我國學者在此基礎上，對各個步驟的條件優化研究較多。鄒力等[17]優化了國標方法，提出實驗操作注意事項，該法VA和VE的回收率分別為92.95%和90.66%，相對偏差分別為1.98%和1.48%，且重現性較好。本文從是否皂化、提取方式、提取溶劑以及應用范圍等方面對我國近年來反向液相色譜在乳制品等食品中VA和VE的檢測應用進行研究（表2）。由上表可知：

（1）乳制品等食品中VA和VE的提取溶劑有石油醚、乙醚、正己烷、甲醇、乙醇等有機試劑，這些溶劑的提取效果基本都能滿足要求。

（2）乳制品等食品中脂溶性維生素會被蛋白質、脂肪等有機大分子會以各種形式包裹在食品顆粒中，需要水解皂化，釋放出來，但保健食品基質簡單，組分單一，無需皂化，直接提取，即可得到較好的分離效果。Turner等[32]等研究用酶解樣品的形式代替皂化過程，使維生素和脂肪達到分離的目的。

（3）液液提取容易產生乳化，這是實驗重復性差的主要影響因素之一。在線固相萃取技術克服了這一問題，又減少了人工操作，易于實現自動化。

（4）高效液相雙波長檢測以及多波長熒光檢測器的聯用為同時測定VA和VE提供了設備保障，減少了分析時間。

（5）在線二維色譜（正向色譜和反相色譜聯用）技術為同時測定VA、VE和VD的含量提供了新思路，縮短了分析時間，適用于批量化處理，但是表2涉及文獻的VA和VE測定均為二維色譜中的反向色譜。

表2 反向液相色譜在乳制品等食品中VA和VE的檢測應用

（6）反向色譜技術具有平衡時間短、使用有機試劑種類少等優點，但是無法實現VA和VE的8 種異構體完全分離的目的。

4.2 正向液相色譜

正向液相色譜在乳制品等食品中脂溶性維生素的檢測應用主要是以GB5009.82—2016[16]第二法為代表的VE檢測方法，該法不經過皂化，液液提取后濃縮進樣。相對于反向高效液相色譜來講，具有操作簡單、重現性好、能夠分離VE的8 種異構體的優點，該法的研究進展如表3。由上表可以看出：

表3 正向液相色譜在乳制品等食品中VA和VE的檢測應用

（1）該法的提取溶劑主要為己烷、醚類等極性有機溶劑。

（2）樣品非經皂化，液液萃取法直接提取即可分離出目標物。

（3）正向高效液相色譜法在乳制品等食品中VE的分析檢測中優勢較為明顯。但由于正向高效液相色譜存在平衡時間長，有機溶劑使用種類多量大等缺點[36]，在檢測實驗室的應用并不普及。

5 高效液相串聯質譜法

高效液相色譜串聯質譜法是一種集高效分離、多組分定性、定量于一體的分析方法，尤其對熱不穩定性化合物的分離和鑒定具有獨特優勢。高效液相串聯質譜法在乳制品等食品中VA和VE的檢測應用如表4。

由表4可以看出，高效液相色譜串聯質譜法對樣品前處理中提取溶劑、提取方式以及是否皂化等因素并無特殊要求，樣品前處理凈化方式除了液液提取，固相萃取外，也可使用凝膠色譜法。該法基質干擾小、并且能夠同時檢測大部分的VA和VE異構體，但是儀器設備貴，需要加內標，成本較高，食品檢測實驗室很難達到全面普及。

表4 高效液相串聯質譜法在乳制品等食品中VA和VE的檢測應用

6 超高效合相色譜法

超高效合相色譜法（Ultra PerformanceConvergence Chromatography，UPC2） 是近年來結合了液相色譜和氣相色譜技術而發展起來的一種分析方法。以超臨界流體CO2為流動相主體，將氣相色譜和液相色譜優勢完美結合，為結構極其相似的手性化合物的拆分提供可能。周圍等[42]采用異丙醇-正己烷（1:1，V/V）溶液提取復合維生素片中11 種脂溶性維生素（VA、VE、VD、VK）及其衍生物，并與超高效合相色譜（UPC2）技術聯用，達到了很好的分離效果，該法加標回收率范圍為97.31% ~98.76%，相對標準偏差為0.41%~0.96%，為多種脂溶性維生素在食品中同時檢測提供了技術支持。

UPC2法具有環境污染小、靈敏度高、重現性好、準確度高以及運行成本低等優點，并為同時檢測乳制品等食品中VA和VE所有異構體提供了新的研究方法。

7 結論

實現前處理的自動化以及多種同分異構體同時檢測是乳制品等食品中VA和VE檢測的研究趨勢和發展方向，但是開發一種重現性好、準確度高并且我國大部分食品檢測實驗室都能普及的檢測方法更具有實際意義，即該檢測方法既要做到技術上可行，也要做到經濟上合理。本文從前處理是否需要造化、提取方式、提取溶劑、檢測儀器、方法適用范圍以及檢測效果等方面綜述了電化學法、分光光度法、氣相色譜（串聯質譜法）、液相色譜法、液相質譜法、高效液相合相色譜法的研究進展。這為乳制品等食品中VA和VE的前處理和上機分析的進一步條件優化提供參考，為我國食品監管部門實現多方位多層級監管提供技術支撐。