斑馬魚模式生物在發育生物學實驗教學中的應用

謝尚論，王春景，李 晶，胡 珂，劉高峰 (蚌埠醫學院生命科學學院生態學教研室， 蚌埠 233030)

發育生物學是在細胞生物學、生物化學與分子生物學、遺傳學和組織胚胎學等學科的基礎上發展起來的一門前沿學科，研究生物體組織器官的發生發育模式、細胞穩態、組織細胞損傷修復和再生過程以及其中的分子調控機制[1]。高等脊椎動物從單個細胞發育而來，經過卵裂、胚胎發生、細胞分化、細胞組裝成組織器官等事件最終成為復雜的多細胞生物體。其中每個過程都是高度動態的，任何一個環節信號調節出現問題都會造成胚胎發育畸形，導致組織器官功能異常，進而引發相應的疾病發生。學習發育生物學的知識可以直接幫助我們了解生物體進化和發育調控的分子機制以及許多先天性和后發性疾病的病理機制，為組織工程和再生醫學的發展，乃至細胞和基因治療提供理論基礎。

隨著近年來實驗技術的進步，發育生物學的內容也在不斷更新，然而發育生物學的實驗課程發展相對緩慢。受限于實驗教學條件，許多普通本科院校未開設或開設很少的發育生物學實驗課程，實驗內容大多是對簡單模式生物胚胎發育過程的觀察，組織器官的觀察也僅限于購買商業切片，留給學生設計和操作的空間不多，這對于培養學生的動手實踐能力和科學興趣是不利的[2]。實驗教學與課堂理論教學相輔相成，學生用自己的實驗結果驗證課堂中學習的理論知識，通過對實驗結果的分析與討論，思考實驗設計和操作步驟中的不足之處，并提出改進方案。這對于激發學生的主觀能動性，提高學生分析與解決問題的能力有促進作用[3]。為了實現教學-科研一體、培養綜合性高素質人才的目標，自2020年下半年起，我們對生物科學、生物技術專業三年級的本科生開設發育生物學實驗課程。

課堂教學中，我們選用的教材為張紅衛主編的《發育生物學》第四版[4]。在2019年教學大綱修訂中，我們增加了脊椎動物眼的發育這一章的教學內容。眼是脊椎動物獲取外界信息的主要器官之一。就人類而言，眼的視覺功能對人類生產生活十分重要。除此之外，眼睛是人類面部較為突出的器官，一雙好看的眼睛可以很大程度上提升人的相貌，因此，發育完好的眼睛還能提升個人的生活幸福指數。隨著我國經濟社會的快速發展，人工照明設備使用的范圍逐漸擴大，光照強度也逐漸增強，光污染正嚴重威脅著人類眼的健康。近年來，白內障、視網膜退變和視神經萎縮等眼科疾病的發生率也在提高[5]。學習眼的發生發育過程以及其中的分子調控機制對醫學院校學生保護眼睛和將來從事臨床眼科疾病的治療工作都是有幫助的。為了配合脊椎動物眼的發育這一章的教學內容，經過詳細的研判，我們認為模式生物斑馬魚適合用來作為實驗材料，開設觀察視網膜分層發育、晶狀體纖維細胞去核和視神經發育過程的綜合性探索實驗[6]。

1 實驗教學設計

1.1 實驗原理

成熟的脊椎動物視網膜最開始從一層均質的神經上皮細胞分化而來，是由五種神經細胞和兩種非神經細胞(視網膜色素上皮細胞和神經膠質細胞)精巧排列的三核層結構。一般而言，視網膜細胞發育過程可大致分為三個階段。第一階段是神經節細胞層生成，發生在胚胎受精后24-36 h，位于視網膜內側、靠近晶狀體的神經節細胞開始分化。此時，視網膜分為兩個核層；第二階段是內核層形成，發生在胚胎受精后36-48 h，包括無長突細胞、水平細胞和雙極細胞在內的中間神經元開始分化。此時，視網膜呈三核層結構；第三階段是外核層形成，發生在48-72 h，感光細胞(視桿細胞與視錐細胞)開始分化，位于視網膜最外側。神經膠質細胞最后分化，橫跨三個核層。晶狀體發育時，晶狀體泡后部的初級纖維細胞向晶狀體腔生長，前部的上皮細胞向兩側赤道部遷移，分裂增殖產生次級纖維細胞。兩種纖維細胞在成熟時需要經歷去核與去細胞器過程，使細胞變得透明。視神經發育時，神經節細胞的軸突匯聚成一束，通過視柄與間腦連接，將視網膜里的信息傳遞給視覺中樞。視神經上沒有感光細胞，是生理盲點，外核層感光細胞在視神經處不連續，從形態結構上可以辨認[7,8]。

冷凍切片技術操作簡單、快捷，是用作觀察胚胎發育過程中組織器官形態變化過程最常用的技術之一。DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)是一種與DNA強力結合的核酸熒光染料，在熒光顯微鏡下用紫外光激發可發出藍光。學生在胚胎發育的不同時期收集斑馬魚幼魚，制作視網膜冷凍切片，通過DNA DAPI染色標記細胞核，可以在熒光顯微鏡下觀察不同發育階段視網膜分層情況、晶狀體纖維細胞去核化過程和視神經的位置與形態特征。

1.2 教學目的

教學目的是使學生掌握成年斑馬魚的飼養、配魚和收卵等操作；使其學會制作視網膜冷凍切片，掌握DNA DAPI染色技術的原理和實驗操作方法，觀察脊椎動物視網膜分層發育、晶狀體纖維細胞去核以及視神經形成的過程與形態特征，以輔助脊椎動物眼的發育這一章的課堂教學；鍛煉本科生的實驗設計與操作能力，培養科研興趣愛好。

1.3 教學的重點與難點

教學重點是讓學生學習并掌握動物組織冷凍切片與DNA DAPI染色技術的原理與實驗操作，對脊椎動物視網膜分層發育、晶狀體纖維細胞去核和視神經發育的過程以及每個時期的組織形態有一個清晰整體的認識。

教學難點是本實驗中用到的是胚胎受精后24-72 h的斑馬魚幼魚，對這些幼魚眼球做縱切片、染色和拍照有一定的難度。有些操作學生或許不能獨立完成，需要在教師的指導下進行。

2 實驗材料與設備

2.1 實驗動物

實驗動物為野生型AB品系性成熟的成年雌雄斑馬魚。

2.2 實驗試劑

實驗試劑包括：胚胎水，pH值為7.2的含有5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl、0.33 mmol/L MgSO4和0.1%(體積比)亞甲基藍的鹽溶液；組織固定液，4%的多聚甲醛；脫水試劑，30%的蔗糖溶液；包埋劑，OCT透明膠；DAPI染色液；封片劑，含50%甘油的PBS溶液；固片劑，普通指甲油。

2.3 實驗儀器

實驗儀器包括：低溫切片機，Leica CM1950；熒光顯微鏡，Obsever Z1；體視顯微鏡；37 ℃培養箱，上海精宏儀器公司GNP-9050。

3 教學安排

3.1 學生分組

為了使每個學生都能充分參與實驗，我們采用小班教學的方式進行本實驗。2-3人一組，小組成員協作完成實驗任務。根據學生實際操作情況，由學生完成全部或者其中部分實驗在教師的指導下完成。

3.2 實驗試劑與材料準備

實驗試劑的準備與配制：本實驗購買商業化的4%多聚甲醛溶液、OCT包埋劑、DAPI染色液(上海碧云天生物公司，C1006)和普通指甲油，需要自己配制的溶液有胚胎水、30%蔗糖脫水溶液(質量體積比，30克蔗糖溶于100毫升雙蒸水中)和含50%甘油的PBS溶液。

不同發育階段的斑馬魚幼魚的收?。盒猿墒斓拇菩跘B品系斑馬魚在28.5 ℃的恒溫養殖系統中飼養，學生每天按14 h光照、10 h黑暗處理，一天喂食三次豐年蟲。前一天晚上喂食過后1 h，學生按雌雄1∶1或1∶2的比例配魚，第二天上午光照半個小時后拔開擋板，讓雌雄魚混合產卵；收的卵中加入胚胎水，置于28.5 ℃的恒溫生化箱中培養，注意換水并挑出死胚胎。本實驗中用到胚胎受精后24-72 h的幼魚，此時的幼魚不需要喂食。學生分別收集胚胎受精后不同發育時期的幼魚，用4%多聚甲醛溶液固定過夜，然后用30%蔗糖溶液脫水，直到幼魚沉到試管底部。

3.3 制作視網膜冷凍切片

整條幼魚用OCT膠包埋在冷凍底座上。學生包埋時讓魚頭朝前，魚尾朝向自己，魚背朝上，魚腹朝下，盡可能使魚身體左右兩側保持水平，這樣切出來的視網膜縱切片效果比較好。包埋好的幼魚放在冰凍切片機的箱體中(-25 ℃)冰凍固定15 min，然后學生開始切片。學生設定切片厚度為6-8 μm，在體視顯微鏡下觀察是否切出理想的觀察視網膜、晶狀體和視神經形態的片子；切好的片子粘貼在防脫載玻片上，并在37 ℃培養箱中烘干20 min。此時的玻片可以直接用于DAPI染色，也可以放于-20 ℃冰箱中保存。

3.4 DAPI染色

學生從-20 ℃冰箱中取出的切片先室溫平衡20 min，再用超純水潤洗2次，每次5 min，去除載玻片上多余的OCT膠；潤洗結束后用紙巾擦干切片上多余的水份，注意不要擦掉視網膜與晶狀體組織；在切片的空余地方滴加稀釋后的DAPI染色液，使組織完全浸沒，室溫避光靜置染色5 min，去除染色液，用PBS潤洗2次，再加入20 μL左右的封片液覆蓋組織，小心蓋上蓋玻片，用指甲油沿蓋玻片邊緣封片；最后將做好的切片放在暗盒中4 ℃保存。

3.5 熒光顯微鏡觀察與拍照

學生用蔡司熒光顯微鏡觀察染色結果并拍照，實驗結果如圖1所示。在胚胎受精后28 h，視網膜細胞未分層，此時的視網膜細胞沒有開始分化，還具有有絲分裂能力。學生在晶狀體中清晰可見初級與次級晶狀體纖維細胞核(圖1A)。胚胎受精后36 h，在視網膜的內側、中央靠近晶狀體的位置分成兩層，此部位的神經節細胞首先分化，此后神經節細胞由視網膜中間區域逐漸向兩側遠端分化。晶狀體纖維細胞去核程序尚未啟動(圖1B)。胚胎發育到48 h，內核層的神經節細胞已經基本分化完成，靠近鼻側視網膜的內核層細胞也開始分化，此時鼻側視網膜呈現清晰的三層結構，而顳側部分內核層細胞分化尚不完全，三層結構不清晰或仍保持兩層結構。此時，晶狀體初級纖維細胞已經完成去核，而次級晶狀體纖維細胞去核尚未開始(圖1C)。到72 h，內核層的中間神經元基本完成分化，外核層的感光細胞也開始分化，此時視網膜整體上呈現清晰的三層結構。晶狀體中次級晶狀體纖維細胞開始去核，視神經結構清晰可見(圖1D)。

圖1 不同發育時期的斑馬魚幼魚視網膜、晶狀體和視神經DAPI染色

4 思考與討論

我們認為模式生物斑馬魚適合作為生物材料開設發育生物學實驗課程，以觀察脊椎動物視網膜分層發育、晶狀體纖維細胞去核和視神經發育的形態變化過程。實驗過程中，小組的每個學生都能積極地參與實驗，尤其對斑馬魚飼養、配魚、收卵、切片和染色等操作感興趣。該小組的實驗結果整體上非常好。從28 h到72 h，學生能看到視網膜由一個單一核層逐漸發育為三個核層的過程，也能看到初級與次級晶狀體纖維細胞隨發育進程的去核化過程，在72 h的視網膜切片中更清楚地觀察到視神經結構。實驗結果與教材內容完全一致，這對于學生加深理解課堂教學內容、培養實驗熱情和科研素養有重要意義。

本實驗中有兩點可以改進的地方：①學生在包埋環節幼魚沒有完全水平放置，導致左右眼睛切片的位置有些不對應，如在48 h與72 h的切片中，右側眼睛的視網膜與晶狀體切片位置與左側不對應；②收取幼魚的時間點可以再增加一些，如36 h與48 h之間增加一個42 h，48到72 h之間增加一個60 h，以便更細致地觀察視網膜分層、晶狀體纖維細胞去核以及視神經發育的過程。

本實驗用到的都是常規儀器設備，操作難度適中。沒有斑馬魚養殖系統的院?？梢灾苯訌膰野唏R魚資源中心購買受精卵。斑馬魚受精卵體外發育，早期不需要特殊照顧，因此，幾乎所有院校都能開設本實驗。另外，教師還可以根據自己的學時情況，在本實驗的基礎上進行延伸，如針對教材中視網膜不同類型細胞的分化受到不同轉錄因子調控的內容，收取不同發育時期的幼魚，提取RNA做反轉錄，以cDNA為模板、設計熒光定量PCR引物，檢測轉錄因子編碼基因pax6、otx2、與rax隨時間的動態表達情況，以加強學生對視網膜細胞分化調控分子機制的理解。