富硒農產品中硒代氨基酸形態及其在不同蛋白組分中的分布

劉 為 尹金晶 吳慕慈 楊 寧 何靜仁, 張 瑞

(1. 武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2. 武漢輕工大學硒科學與工程現代產業學院，湖北 武漢 430023)

硒是人體必需營養素之一，具有抗氧化、抗病毒、調節免疫等生理功能，與人類健康密切相關[1-3]。在自然界中，硒主要以無機硒和有機硒兩種形式存在，植物、動物和微生物等可將無機硒轉變為有機硒，植物中的有機硒主要以游離的硒代氨基酸和硒蛋白中結合態硒代氨基酸形式存在[4]。研究[5-6]證明，無機硒對機體的安全閾值窄，過量攝入會導致人體中毒，而有機硒毒害低、生物活性強，且比無機硒更易被人體吸收利用。由于人體無法自行合成有機硒，必須依賴外源性膳食攝入，且不同形態硒在人體內的生物學效應和生物利用率差異較大，因此尋找一種靈敏、準確和可靠的檢測方法以確定食物硒化合物的形態及含量，對進一步評估富硒產品的營養價值和含硒化合物對人體健康影響具有重要意義。

目前硒形態檢測的常用方法為高效液相色譜—電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)和高效液相色譜—氫化物發生—原子熒光光譜(HPLC-HG-AFS)[7]，其中HPLC-HG-AFS因原理簡單、測試光譜干擾較少、分析時間短、成本較低等諸多優點而被廣泛應用[8]。植物樣品中有機硒的提取及硒形態分析的前處理過程中，酶水解法具有反應條件溫和及可防止物質原始形態轉變的優點，是當前被廣泛應用的方法，也是硒形態測定樣品前處理的關鍵過程[9]。目前富硒農產品及硒蛋白類營養補充劑層出不窮，總硒含量的測定、硒形態分析及富硒農產品資源的營養評價也日益增多[4]，但有關不同科屬富硒農產品的有機硒代氨基酸形態比較及其在不同溶解性蛋白組分中的分布差異特點研究尚未見報道。因此，研究擬優化硒形態測定前處理和液相色譜分離分析條件，建立一種基于HPLC-HG-AFS的硒代氨基酸測定方法，分析禾谷類和十字花科富硒農產品中典型硒代氨基酸形態含量及其在不同溶解性蛋白組分中的差異化分布特點，旨在為富硒農產品不同溶解性蛋白資源進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

富硒西蘭花：深圳福山生物科技有限公司；

富硒大麥苗：湖北吉田有限公司；

富硒大豆：黑龍江新三農大豆種植合作社；

富硒玉米：湖北恩施德源健康科技發展有限公司；

SeCys2、MeSeCys、SeMet標準溶液：中國計量科學研究院；

SeEt標準品：北京百靈威科技有限公司；

蛋白酶E、蛋白酶K：北京索萊寶科技有限公司；

中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

檸檬酸、鹽酸、硝酸：優級純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲醇：色譜純，美國Fisher公司。

1.2 主要儀器與設備

原子熒光光譜儀：AFS-8530型，北京海光儀器有限公司；

微波消解儀：Multiwave PRO型，奧地利安東帕有限公司；

高速冷凍離心機：FC5718R型，奧豪斯儀器(美國)有限公司；

超純水系統：Milli-Q Syhthesis型，美國Millipore公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-924385-III型，上海新苗器械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 富硒農產品前處理 將富硒西蘭花、富硒大豆、富硒玉米、富硒大麥苗4種富硒農產品原料于60 ℃烘干，粉碎過80目篩。取干燥粉末，以料液比1∶10 (g/mL)加入正己烷，攪拌提取3 h，重復提取3次，脫脂后置于通風櫥揮干殘余正己烷，獲得脫脂粉末。

1.3.2 富硒農產品各級蛋白制備 參照Osbonre[10]的方法，根據各級蛋白的不同溶解性，從富硒西蘭花、富硒大豆、富硒玉米、富硒大麥苗中依次提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

1.3.3 硒含量測定 參照GB/T 5009.93—2017。

1.3.4 標準溶液配制 分別取硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)標準液和硒代乙硫氨酸(SeEt)標準品，用超純水分別配置成質量濃度為1.0 mg Se/mL標準儲備液，混合稀釋成質量濃度為5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg Se/L的標準工作液，現配現用。

1.3.5 樣品前處理 稱取0.1 g樣品，加入3 mL一定濃度的蛋白酶溶液，振蕩搖勻，迅速放入37 ℃恒溫水浴振蕩，酶解提取后，10 000 r/min離心20 min，過0.22 μm濾膜，備用。選用硒含量較高的富硒西蘭花樣品對提取硒形態的酶解條件進行優化，并按式(1)計算提取效率。

(1)

式中：

X——提取效率，%；

A1——樣品中4種有機硒形態測定值總和，mg/kg；

A0——樣品硒含量，mg/kg。

1.3.6 儀器條件

(1) 液相色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-Aq C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為15 mmol/L 檸檬酸+5 mmol/L 己烷磺酸鈉(含3%甲醇)，流速1.0 mL/min，進樣量100 μL。

(2) 氫化物發生參數：載流為10% HCl；還原劑為2.5% KBH4+0.5% NaOH；消解劑為0.15% KI+0.5% KOH；蠕動泵轉速40 r/min，開啟紫外燈。

(3) 原子熒光檢測參數：硒空心陰極燈；燈電流80 mA；負高壓380 V；載氣、屏蔽氣為氬氣；流量分別為300，800 mL/min；原子化高度8 mm。

1.3.7 數據分析 每個樣品設置3個平行組，使用SPSS 23 對試驗數據進行處理，使用Origin 9.0 作圖。

2 結果與分析

2.1 4種富硒農產品的硒含量

富硒西蘭花總硒含量[(154.19±1.37) mg/kg]遠超其他富硒玉米[(3.05±0.17) mg/kg]、富硒大豆[(2.84±0.11) mg/kg]和富硒大麥苗[(1.82±0.14) mg/kg]，根據作物的總硒含量可知，富硒大豆、富硒玉米、富硒大麥苗均為非聚硒植物(<100 mg/Se kg·DW)，而富硒西蘭花為次級聚硒植物(100～1 000 mg/Se kg·DW)[11-12]。

2.2 樣品前處理條件優化

2.2.1 蛋白酶的篩選 由圖1可知，蛋白酶E對硒形態的提取效果最佳，提取效率可達62.6%，其次是蛋白酶K，提取效率為57.1%；其他蛋白酶的提取效率均低于50%，硒形態提取效果一般。蛋白酶E和蛋白酶K對硒的提取效率較好，與林樾等[13]的結果相符，這可能是由于蛋白酶K和蛋白酶E是活性廣泛的絲氨酸蛋白酶，無特異性，具有促進酶水解的各種限制性位點和性質，可將硒蛋白分解成更小、更短的肽和氨基酸，從而獲得更高提取效率[9,14]。

圖1 酶種類對4種硒形態提取效果的影響

2.2.2 酶解時間的篩選 由圖2可知，當酶解時間>4 h時，提取效率不再提高，隨著酶解反應的進行反應體系pH會有所下降，同時長時間酶解的外力環境下SeCys2等硒代氨基酸穩定性會受到不同程度的影響，導致含量測定值有所降低[15-16]，故選擇4 h為最適酶解時間。

圖2 酶解時間對4種硒形態提取效果的影響

2.2.3 加酶方式的篩選 由圖3可知，采用先添加蛋白酶E水浴2 h后再添加蛋白酶K水浴2 h的酶解方式提取效果最好，提取效率可達76.87%，高于單獨使用蛋白酶進行酶解提取，與林樾等[13]的結論相符。故選擇先添加蛋白酶E水浴2 h后再添加蛋白酶K水浴2 h的酶解方式對樣品硒形態進行提取。

a. 只添加蛋白酶K b. 只添加蛋白酶E c. 先添加蛋白酶E水浴2 h后再添加蛋白酶K水浴2 h d. 先添加蛋白酶K水浴2 h后再添加蛋白酶E水浴2 h e. 同時添加蛋白酶E和蛋白酶K水浴4 h

2.2.4 蛋白酶添加量的篩選 由圖4可知，隨著蛋白酶添加量的增大，樣品中硒形態提取效率有所提高，當蛋白酶添加量為3.0%時，硒形態的提取效率最佳，再繼續增大蛋白酶用量，樣品中硒形態提取效率變化不明顯，故選擇蛋白酶添加量為3.0%進行樣品有機硒形態的提取。

圖4 蛋白酶添加量對4種硒形態提取效果的影響

2.3 色譜條件優化

2.3.1 色譜柱的選擇 以檸檬酸溶液作為流動相，分別選用PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和ZORBAX SB-Aq C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)進行測試。結果表明，PRP-X100陰離子交換柱只能分離除SeEt以外的3種硒代氨基酸組分，而ZORBAX SB-Aq C18反相色譜柱可以有效分離4種硒代氨基酸組分，因此選用ZORBAX SB-Aq C18柱作為液相分離色譜柱。

2.3.2 流動相條件優化

(1) 流動相的選擇：在硒形態研究中，磷酸鹽溶液和檸檬酸鹽溶液常被用作流動相，使用ZORBAX SB-Aq C18柱，調整流動相濃度為15 mmol/L。結果顯示，磷酸氫二銨溶液作為流動相時，只能分離出SeCys2、MeSeCys、SeMet 3個組分，而檸檬酸溶液作為流動相時4種硒代氨基酸均可順利出峰，因此選擇檸檬酸溶液進行進一步優化。

研究[17]表明，在硒形態分離時，向流動相中添加一定量離子對試劑可以有效改善分離效果及峰形。由圖5可知，離子對試劑的加入使得4種硒形態均達到基線分離，當離子對試劑濃度增大時，各有機硒組分的出峰時間及峰形改變并不明顯，綜合考慮出峰情況和色譜柱耐受性，選擇己烷磺酸鈉添加濃度為5 mmol/L。

圖5 己烷磺酸鈉濃度對4種硒形態分離效果的影響

由圖6可知，未添加甲醇時，SeEt組分出現雙峰及拖尾現象，隨著甲醇的加入，峰形得到明顯改善。當甲醇添加量>3%時，各色譜峰強度及峰形變化較小，且分離度受到影響，綜合分析峰形及出峰時間，選擇甲醇添加量為3%。

圖6 甲醇添加量對4種硒形態分離效果的影響

(2) 流動相濃度的選擇：使用ZORBAX SB-Aq C18反相色譜柱時，流動相濃度變化對4種硒形態的分離效果無明顯影響，同時考慮到高鹽含量不利于色譜柱及儀器的保養，選擇15 mmol/L檸檬酸溶液作為流動相。

(3) 流動相pH的選擇：當pH>4.0時，SeCys2和MeSeCys無法實現分離；當pH為3.0～4.0時，隨著pH的增大，各組分出峰時間有所提前(見圖7)，特別是SeEt組分受影響明顯，可以縮短分析時間，故選擇流動相pH為4.0。

圖7 4種硒代氨基酸混合標樣的液相色譜圖(100 μg Se/L)

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線與檢出限 由表1可知，4種硒形態線性關系良好，R2≥0.999 3，該方法下4種硒代氨基酸檢出限為0.86～2.79 μg/L。

表1 4種硒代氨基酸的線性關系和檢出限

2.4.2 回收率與精密度 由表2可知，富硒西蘭花、富硒大豆、富硒玉米、富硒大麥苗中各硒形態相對標準偏差值(RSD)均<5%，加標回收率分別為78.5%～104.1%，89.4%～103.7%，76.5%～106.8%，87.3%～103.5%，說明方法的準確性和重復性良好，可以滿足檢測需求。

表2 富硒西蘭花的加標回收率?

2.5 樣品分析

由表3可知，從硒代氨基酸整體來看，富硒西蘭花的球蛋白和谷蛋白組分中均存在SeCys2、SeMet、MeSeCys、SeEt 4種硒代氨基酸，富硒西蘭花清蛋白和醇溶蛋白組分，富硒玉米谷蛋白組分均含有除SeEt以外的其他3種硒代氨基酸，其余硒蛋白組分中則只含兩種或一種硒代氨基酸。

表3 富硒農產品各級蛋白組分中4種有機硒形態含量?

由圖8可知，富硒大豆、富硒玉米和富硒大麥苗不同溶解性蛋白中主要硒代氨基酸為SeMet，SeMet在此3種原料蛋白的硒代氨基酸中占比可達66%以上，其中富硒玉米除谷蛋白有SeCys2和MeSeCys檢出，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白中均只檢出SeMet。SeMet是富硒農產品不同溶解性蛋白中均有分布的硒代氨基酸，其普遍存在于富硒植物蛋白這一特點與SeMet代謝吸收途徑密切相關。SeMet在植物中的生物合成途徑與蛋氨酸(Met)十分相似，在Met的合成過程中tRNA對S和Se并無特異性識別，使得SeMet可以直接進入富硒植物蛋白質，大豆、玉米、大麥苗這類非聚硒植物蛋白質中硒代氨基酸主要以SeMet形式存積[18]。富硒大麥苗蛋白中除了SeMet，還存在著一定比例的SeCys2，但含量較少，可能與大麥苗吸收轉換硒的能力有關。

圖8 4種富硒農產品各級蛋白中有機硒形態占比

富硒西蘭花作為十字花科植物中次級聚硒植物，其各級蛋白中硒代氨基酸含量較高。土壤中的硒被植物吸收后經過S代謝途徑被還原或轉化為SeCys和SeMet，這兩種硒代氨基酸在蛋白質中進行非特異性結合，代替了部分Cys和Met參與其中，然而，當硒被過度積累時會致使蛋白質的折疊中斷，從而引發中毒反應，為避免中毒，許多十字花科植物會通過甲基化的方式轉變硒的儲存形式，因此西蘭花中存在較高含量的MeSeCys[11,19]。在西蘭花清蛋白和谷蛋白中檢出MeSeCys含量分別為21.53，16.05 mg/kg。研究[20]表明，植物中MeSeCys不進入蛋白質而直接存于植物，但此類硒代氨基酸可被提取劑提取出來，因而推測在蛋白質提取的同時，西蘭花中大量存在的MeSeCys仍會被溶出，繼而被檢出。

除SeMet外，可直接被結合進入蛋白的SeCys2也在大豆、玉米、大麥苗3種禾谷類植物中有所分布，富硒西蘭花球蛋白和谷蛋白中除SeMet、SeCys2和MeSeCys外，還分布有少量的SeEt。十字花科植物西蘭花和禾谷類植物的硒形態分布之間存在一定差異，與西蘭花更為復雜、多樣的硒代謝途徑有關，其防中毒機制也在一定程度上豐富了有機硒的存在形式。

3 結論

通過對樣品前處理條件和色譜條件進行優化，建立了高效液相色譜—氫化物發生—原子熒光光譜聯用測定富硒西蘭花、富硒玉米、富硒大豆、富硒大麥苗中SeMet、SeCys2、MeSeCys、SeEt 4種有機硒形態的方法。結果表明，該方法操作簡單、重復性好、準確性高、成本低，滿足富硒農產品中多種有機硒形態檢測需要。大豆、玉米、大麥苗3種禾谷類富硒農產品蛋白中硒代氨基酸主要以SeMet形式存在，而十字花科的富硒西蘭花蛋白中SeCys2、SeMet和MeSeCys占比較高，且硒代氨基酸在不同蛋白組分中的賦存形式及含量也存在差異。后續可探究高有機硒蛋白組分的抗氧化活性及功能特性。