光酶級聯催化降解有機污染物

俞曉敏 潘戴清 龍青云 陳曉陽

(嘉興學院生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001)

目前，大量人工合成有機化合物的使用、工業三廢的違規排放嚴重污染了環境，威脅食品安全。其中酚類[1]、有機染料[2]等有機污染物具有毒性大、難降解的特點，在水產動物中富集[3]，嚴重威脅著水生生物和人類的健康[4]。以食品加工行業為例，部分人工合成的偶氮染料被允許作為食品的著色劑使用，如日落黃、酸性紅、胭脂紅等[5]，而4-己基間苯二酚、特丁基對苯二酚(TBHQ)、二丁基羥基甲苯(BHT)等酚類化合物是常用的抗氧化劑[5]，可以提升食品的外觀和延長存儲期，但同時也會對環境造成危害[6]。目前，針對有機污染物的處理技術包括吸附[7]、光催化氧化降解[8]、超聲輔助降解[9]、生物降解[10]等。其中辣根過氧化物酶(HRP)廉價易得，處理過程安全環保，且對該類污染物的降解具有良好的效果，是最常用的催化劑之一[11-14]。

過氧化物酶催化有機分子的氧化降解需要添加過量的過氧化氫作為氧化劑，這帶來了一系列問題。首先，高濃度的過氧化氫會快速降低酶的活性，限制了過氧化物酶在有機污染物降解中的應用，特別是在針對一些濃度較大的廢水時；其次，過氧化氫作為一種不穩定的強氧化性物質，其貯藏和運輸需要耗費大量的人力物力，甚至存在安全隱患；此外，過氧化氫被世界衛生組織列為三類致癌物質，可能會危害操作工人的健康。如果能在體系中原位生成過氧化氫，無需額外添加，則可以避免上述問題。

在水相體系通過光催化原位生成過氧化氫，作為過氧化物酶催化反應的氧化劑，是近年來在過氧化物酶催化反應中發展出的新策略。研究發現，以金摻雜二氧化鈦(Au-TiO2)[15-16]、g-C3N4[17]、黃素(FMN)[18]和蒽醌磺酸(SAS)[19]作為光催化劑，在氧氣存在下將水或甲醇氧化成過氧化氫，再利用多種過氧化物酶催化羥基化、鹵化、環氧化等反應，具有較好的催化效率和底物譜。Kim等[20]以木質素作為光敏劑，結合過氧化物酶催化實現了碳氫鍵的氧化官能化，總轉化數(TTN)達81 000。這種級聯的光酶催化體系具有良好的應用前景，可將其引入污水處理領域?？紤]到催化效率、操作難度、成本等因素，研究擬構建Au-TiO2和辣根過氧化物酶的光酶級聯催化體系，考察其在酚類化合物和有機染料等有機污染物降解中的催化效果，旨在為污水處理領域提供一種安全環保的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫外—可見分光光度計：UV 2550型，日本島津公司；

燈泡：7748型，電壓24 V，功率250 W，色溫3 400 K，光通量5 000 LM，荷蘭皇家飛利浦公司；

場發射掃描電子顯微鏡：S-4800型，日本高新技術公司；

辣根過氧化物酶(HRP)：≥250 U/mg，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；

染料：山東優索化工科技有限公司；

AuCl3、TiO2、苯酚、間苯二酚等：分析純，薩恩化學技術(上海)有限公司。

1.2 催化劑制備

按文獻[16]的方法制備光催化劑Au-TiO2。

1.3 降解率測定

在紫外—可見光波長范圍內對酚類化合物和染料溶液進行掃譜，根據吸收曲線確定其最大吸收波長，并測定此波長下不同濃度樣品的吸光度，270 nm下吸光度與苯酚濃度之間的線性方程為y=1.226 95x+0.076 58，R2=0.999 7；270 nm下吸光度與間苯二酚濃度之間的線性方程為y=1.0264 3x-0.071 33，R2=0.999 8；508 nm下吸光度與酸性紅1濃度之間的線性方程為y=0.850 1x-0.004 08，R2=0.999 5。

測定降解反應前后樣品的吸光度值，并按式(1)計算降解率。

η=(C0-Ct)/C0×100%，

(1)

式中：

η——酚類化合物或有機染料的降解率，%；

C0——樣品初始濃度，mmol/L；

Ct——t時刻降解后的濃度，mmol/L。

1.4 光酶催化有機污染物降解

向敞口的5 mL離心管中加入緩沖溶液，不同濃度的酚類化合物或有機染料，一定量的光催化劑Au-TiO2和HRP，在管口上方10 cm處設置光源，恒溫下以1 500 r/min 振蕩5～40 min，離心除去粉末固體，上清液以緩沖液稀釋1～10倍后用紫外—可見分光光度計測定吸光度。

1.5 過氧化氫濃度測定

參照文獻[21]的方法，400 nm下吸光度與過氧化氫濃度之間的線性方程為y=0.686 86x+0.003 36，R2=0.999 6。

2 結果與分析

2.1 光酶催化反應條件對酚類化合物降解效果的影響

在pH值為4.0的磷酸緩沖溶液中加入1 mmol/L苯酚、0.5 g/L不同晶型[銳鈦礦型(A)和金紅石型(R)]的Au-TiO2、30 mg/L HRP酶，光照下反應10 min后發現，以銳鈦礦型為原料的Au-TiO2中苯酚降解率達到68.3%，而金紅石型的為59.7%，說明該光酶級聯的催化體系在催化降解苯酚中是可行的，其中銳鈦礦型Au-TiO2具有較好的催化效果。

由圖1可知，當pH為4.5時，降解率達最高72.2%，是由于HRP適合在弱酸性環境中催化，而過低或過高的溫度都會影響酶的活性，同時過氧化氫在高溫下容易分解，影響最終的降解率，故最佳溫度為30 ℃，此時苯酚降解率為82.0%。當反應時間為10 min時，降解率達到峰值，繼續延長反應時間，降解率有所降低，說明該反應是一個高效的催化過程，具有良好的應用潛力。

圖1 光酶催化苯酚降解

間苯二酚具有二元酚結構，是一種常用的酚類精細化工原料，排放的間苯二酚會在生物體和自然環境中累積，生物降解較為困難。由圖2可知，相較于苯酚，間苯二酚更難降解，當反應時間為10 min時，降解率為63.5%；當反應時間為20 min時，降解率達最高74.1%。由于兩者反應條件相似，降解速率和降解率的下降歸因于HRP對間苯二酚的反應活性比苯酚低。

圖2 光酶催化間苯二酚降解

2.2 光酶催化對偶氮染料的降解

由圖3可知，當反應時間為40 min時，染料去除率達82.1%。當反應時間為20 min時，酸性黃36、直接藍6、直接綠6 3種染料的降解率為90%以上，當將染料濃度提高到1 mmol/L時，3種染料在反應時間為40min時，其降解率也能維持在80%左右，說明光酶催化體系在催化染料降解中具有良好的性能。反應體系中，染料種類對于催化效率的影響是多方面的，一方面染料的顏色會對光催化劑吸收光的波長和能量產生影響，另一方面，染料是在酶的活性空腔內進行催化降解的，所以各取代基結構也會影響染料與酶的結合作用，進而影響催化速率。

a為染料濃度0.1 mmol/L,反應時間40 min;b為染料濃度0.1 mmol/L,反應時間20 min;c為染料濃度1 mmol/L,反應時間40 min

2.3 光酶催化機理

由表1可知，在不加酶的條件下(反應1、2)，體系中的苯酚幾乎不能被降解，說明酶在反應中起著關鍵作用，以原位生成的過氧化氫為氧化劑催化降解苯酚。在無光照的條件下，無論是哪種晶型的Au-TiO2，都不能產生過氧化氫供酶使用(反應1、3)。在不加光催化體系中，向反應中添加3當量的過氧化氫，得到類似的催化效果(反應4)，證明光酶催化體系可以避免過氧化氫的使用，解決了過氧化氫使用過程中的一系列問題。

表1 苯酚催化降解的對照試驗?

該光酶催化體系中，與金紅石型的Au-TiO2光催化劑相比，銳鈦礦型的Au-TiO2光催化劑具有較好的催化效果。由圖4可知，銳鈦礦型和金紅石型兩種Au-TiO2催化劑都具有比較窄的粒徑分布，基本集中在50 nm左右。但從長寬比來看，銳鈦型的Au-TiO2比較小，而金紅石型呈類似棒狀的趨勢。從堆積方式看，銳鈦型的比較緊密，而金紅石型的比較松散，可能是微觀形貌的不同引起了催化活性的差別。光照條件下，反應10 min后，銳鈦礦型的反應中產生1.43 mmol/L過氧化氫，而金紅石型的反應中產生0.85 mmol/L過氧化氫，說明銳鈦礦型Au-TiO2催化生成過氧化氫的反應更快，對整體的級聯降解反應更有利。

圖4 兩種晶型Au-TiO2的SEM表征圖

綜上，提出該光酶催化降解有機污染物的機理：兩種催化是以級聯的方式進行反應的，第一步光催化生成的過氧化氫剛好被后一步酶催化反應所利用，共同達到降解有機污染物的目的(圖5)。

圖5 光酶催化有機污染物降解機理圖

3 結論

制備了兩種晶型的金摻雜二氧化鈦光催化劑，并與辣根過氧化物酶級聯催化實現了2種酚類化合物和6種偶氮染料的降解。結果表明，在30～40 ℃以及弱酸性環境下，有機污染物的降解率達68%～98%，證實了反應過程是由光催化生成過氧化氫和辣根過氧化物酶利用過氧化氫氧化降解有機污染物兩步組成，其催化降解效率與添加過氧化氫相當。該方法避免了使用大量過氧化氫可能產生的問題，是一種具有潛力的污水處理手段。隨著有機污染物濃度的升高，研究構建的催化降解方法效率下降明顯，可能是由于酶的部分失活，在后續研究中希望通過固定化或定向進化等手段提高酶的穩定性，進一步拓展該體系的應用范圍。