微生物法測定嬰幼兒奶粉中泛酸含量的研究

賀 燕 鐘菲菲 王曉慶 徐文泱 楊 滔

(1. 湖南省產商品質量檢驗研究院，湖南 長沙 410000；2. 長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410000)

泛酸又名維生素B5，是一種重要的水溶性維生素。它具有酸性，易溶于乙醇和水，不溶于脂類溶劑，在酸性環境中易分解，在中性環境中較為穩定，是嬰幼兒乳粉中添加的重要營養強化劑[1-4]。目前泛酸的檢測方法有微生物法、高效液相色譜法、酶聯免疫法、超高效液相色譜—串聯質譜法(UPLC-MC/MS)[5-7]。微生物法主要是利用植物乳桿菌對泛酸的特異性，在含有泛酸樣品中根據生長產生的光密度來測定泛酸的含量[8]，此方法靈敏度高，不僅能檢測出強化泛酸，還能檢測出原生泛酸，這是較儀器方法的優異之處[9]。但由于現有的微生物方法GB 5009.210—2016中關鍵步驟試驗條件不具體(菌液濃度的把控等)、提取方法存在不足、試驗過程繁瑣(吸光度的測定)等，導致此方法具有操作過程既復雜，檢驗試驗又易失敗等缺點[10]。研究主要從菌種的選擇、濃度的確定、樣品前處理方法、吸收光度測定方法等方面進行深入研究，優化目前用于泛酸檢測的微生物方法，以期為后續國標檢測方法的修訂提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

嬰幼兒奶粉：市售；

質控樣品：山東美正生物科技有限公司；

ATCC 8014植物乳桿菌、CICC 6076植物乳桿菌：上海北諾生物科技有限公司；

泛酸鈣標準品：95.5%，德國DR.Ehrenstorfer公司；

乙酸鈉、乙醇、鹽酸：分析純，國藥集團藥業股份有限公司。

1.2 儀器

電子天平：ME204E型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

紫外分光光度計：T9型，普析通用儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：HVA-85型，日本平山制作所株式會社廠；

培養箱：MIR-254型，松下電器(中國)有限公司；

酶標儀：Infinite M200型，美國Tecan公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物乳桿菌的選擇及制備優化

本文以休閑口味調味泡菜脆口蘿卜為例，引用Q10方法[5]，通過加速貨架期試驗[6](Accelerated Shelf-life Testing，ASLT)研究了3種不同包裝材質對脆口蘿卜貨架期的影響。為該類型的產品選擇合適的包裝材料提供了重要的數據支撐。

(1) 不同來源的植物乳桿菌菌種測試：GB 5413.17—2010《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定》和GB 5009.210—2016《食品安全國家標準 食品中泛酸的測定》中的微生物法均采用ATCC 8014植物乳桿菌，而對于其他來源的植物乳桿菌則未提及。采用不同來源的植物乳桿菌即ATCC 8014植物乳桿菌、CICC 6076植物乳桿菌，按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)來測定質控樣品及市售嬰幼兒配方奶粉，分析不同來源的植物乳桿菌對嬰幼兒奶粉中泛酸測定的影響。

(2) 菌液濃度對測定結果的影響：將保存的ATCC 8014轉接到乳酸桿菌瓊脂培養基上，36 ℃培養18～24 h，再將其接種于乳酸桿菌肉湯中，36 ℃培養24 h。肉湯培養物先500 r/min 離心10 min留菌液，再以2 500 r/min 離心10 min，再將沉淀物用無菌生理鹽水洗滌3次。添加菌液或無菌生理鹽水將透光率調至60%，70%，80%，90%，以此菌懸液作為測試菌液用來測定樣品，菌液的添加量為50 μL。按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)，研究不同濃度的菌液直接添加至待測液中對測定結果的影響。

(3) 菌液添加量對測定結果的影響：為簡化菌液的制備和添加過程，制備系列5 mL乳桿菌接種肉湯，分別接種活化后的植物乳桿菌斜面培養物1環，于36 ℃培養20 h，將肉湯培養物首先500 r/min離心10 min留菌液，再將菌液以2 500 r/min離心10 min，再將沉淀物洗滌3次，充分洗滌后按2.5，5.0，10.0 mL的菌液量添加到400 mL泛酸測試培養基中，按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)測定質控樣品，比較相同測試培養基添加不同菌液量對測定結果的影響。

1.3.2 泛酸樣品前處理方法 分別采用GB 5413.17—2010水解法和GB 5009.210—2016的直接提取法，對泛酸質控樣品及奶粉樣品進行測定，比較不同樣品前處理方法對結果的影響。

1.3.3 吸光度測定方法 吸光度的測定有紫外分光光度法和酶標儀測定方法，對質控樣品、市售的5個奶粉以及加標樣品按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)處理，分別采用紫外分光光度法和酶標儀法測定吸光度，比較吸光度測定方法對測定結果的影響。

1.3.4 加標試驗 以9號樣品的奶粉作為試驗樣品，添加10 μg加標按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)進行試驗，本底樣品和加標樣品分別進行6次平行試驗，分析酶標法測定對結果的影響。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌的選擇及制備優化

2.1.1 不同來源的植物乳桿菌菌種對測定結果的影響

用ATCC 8014植物乳桿菌和CICC 6076植物乳桿菌按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)檢測質控樣品及市售奶粉樣品1號、樣品2號、樣品3號測定泛酸結果見表1，標準曲線見圖1。

圖1 不同植物乳桿菌測定的標準曲線圖

表1 不同來源的植物乳桿菌測定泛酸結果表

采用ATCC 8014植物乳桿菌、CICC 6076植物乳桿菌按照GB 5009.210—2016第一法(微生物法)測定的3個奶粉樣品和質控樣品，相對標準偏差在0.82%～6.59%，在允許的相對偏差范圍內。此外，以兩種不同來源的植物乳桿菌菌株得到的標準曲線性方程y=0.004 8x+0.041 5(R2=0.995 2)和y=0.004 3x+0.041 8(R2=0.993 0)，線性良好且二者線性范圍一致，說明ATCC 8014植物乳桿菌和CICC 6076植物乳桿菌均可用來測定嬰幼兒配方奶粉中的泛酸含量。有關研究[11-13]及現有標準(GB 5009.210—2016和GB 5413.17—2010)均使用ATCC 8014植物乳桿菌測定泛酸，該菌貨期長，但價格昂貴。

2.1.2 不同濃度菌液直接添加至待測液中對測定結果的影響 用無菌生理鹽水調制透光率分別為60%，70%，80%，90%的菌液，由不同的菌液濃度得到的泛酸標準曲線見圖2，測定的質控樣品結果見表2。

表2 不同濃度菌液測定的質控樣品結果

由圖2可知，透光率為70%，80%，90%時，曲線吸光度值基本上呈線性增加，透光率為80%時菌液濃度所得標準曲線的線性最好，泛酸標準曲線方程為y=0.007 3x-0.044 3，相關系數R2為0.991 2。分析原因為：接種 60%透光率的菌液濃度的標準曲線由于菌液濃度較高，當達到高濃度標準值(90～100 ng/mL)時，定量標準物質消耗后，植物乳桿菌繁殖增加速度減緩，吸光度值增加幅度變緩，故曲線明顯趨向于持平；當接種90%透光率菌液時，因為接種量較少，在低含量的營養成分的條件下，繁殖增加緩慢，較低濃度的吸光度值特別低。利用植物乳桿菌對泛酸的特異性進行檢測時，添加菌液濃度至關重要，菌液濃度不宜太高，太高則會出現高濃度標準值(90～100 ng/mL)的吸光值無明顯變化，太低則會出現低濃度標準值的吸光度值過低，同時不同管之間的平行性較差。

圖2 不同濃度菌液直接添加至待測液中所得的標準曲線

從測定質控樣品的結果來看，添加菌液透光率為60%～90%時結果均在質控樣品允許接受的范圍內，但從標準曲線的線性以及平行測試管的平行性來看，以添加透光率為80%的菌液50 μL至測試管中，得到的標準曲線及樣品測定結果最佳。GB 5009.210—2016和GB 5413.17—2010標準方法及現有研究中對于菌液濃度的定量不明確或者范圍很廣，研究定量菌液濃度數據結果，有利于檢測操作的標準化，確保檢驗試驗的成功和檢測結果準確。

2.1.3 不同的菌液量直接添加至測試培養基中對測定結果的影響 國標方法及現有研究中一般接種一定范圍內的透光率的菌液，此方法需要經過多次調試和測定菌液濃度，對于初學的檢測者難度較大。為減少菌液的制備及接種過程，研究直接添加到測試培養基的菌液添加量，便于檢測過程的標準化操作。按2.5，5.0，10.0 mL的菌液量添加到400 mL泛酸測試培養基中，用來測定質控樣品，得到接種2.5 mL菌液的標準曲線和測試樣品在低濃度時，培養后吸光度值過低，而添加10.0 mL菌液的標準曲線在高標準液濃度70 ng/mL以上增加緩慢，在90，100 ng/mL 的標準溶液濃度吸光度值基本無變化。因而以添加5.0 mL菌液到400 mL泛酸測試培養基中得到的標準曲線及樣品測定結果最佳(見圖3)，線性極好，R2達到了0.996 9，測定得到的質控樣品結果為3.83×103μg/100 g(質控樣品泛酸參考值為2 970～4 610 μg/100 g)，基本接近中位值。

圖3 接種5.0 mL菌液至400 mL泛酸測試培養基得到的標準曲線

2.2 樣品前處理方法

由表3可知，利用水解法和直接提取法提取泛酸，兩種方法所得結果不一致，直接提取法明顯高于水解法，兩者測定的結果相對偏差范圍達到了12%～32%。其原因是：① 水解法中泛酸的提取通過121 ℃水解來實現，該過程可能會造成游離泛酸的分解而導致總泛酸測定結果偏低；② 直接提取法提取奶粉中全部的水溶性維生素包括生物素、煙酸也將全部被提取出來，生物素和煙酸對植物乳桿菌也有特異性，能促進植物乳桿菌的生長而導致測定結果偏高，另外，直接提取法提取不經過濾，樣品液明顯呈現渾濁狀態，也可能導致結果偏高。

表3 兩種前處理方法所得泛酸結果分析表

2.3 吸光度測定方法

GB 5413.17—2010第一法(微生物法)和GB 5009.210—2016第一法(微生物法)均要求采用紫外分光光度進行測定。此法最大的弊端是開展大批量樣品檢測時耗時長，并會導致后續樣品測定結果偏高，而酶標儀測定吸光度的速度則較快。從表4結果來看，用紫外分光光度法和酶標儀測定的1個質控樣品及5個奶粉樣品相對偏差在1.0%～4.8%，在GB 5413.17—2010第一法(微生物法)和GB 5009.210—2016第一法(微生物法)允許的偏差誤差范圍內。由表5可知，采用酶標儀測定吸光度的加標回收率達到了96.9%，相對標準偏差為4.95%，回收率符合要求且測定方法的精密度高。為減少現行國標法檢測泛酸時檢測吸光度的繁瑣程度，建議改用酶標儀進行測定，此法方便，測定耗時短，準確度高。

表4 不同吸光度測定方法的結果分析

表5 酶標法測定9號加標樣品的結果分析表?

3 結論

(1) 植物乳桿菌CICC 6076作為測試菌株用來測定嬰幼兒食品中的泛酸含量具有和植物乳桿菌 ATCC 8014同等的效果，建議在允許(如內銷食品檢驗)時替換使用。

(2) 為利于檢測的標準化操作，對微生物法關鍵測定步驟的菌懸液準備研究出兩種標準化的定量操作條件：① 直接接種透光率為80%的菌液50 μL于滅菌測試管中；② 采用5 mL菌液(單一菌落接種5 mL乳桿菌肉湯培養20 h后的培養液)添加至400 mL滅菌測試培養基中，后者操作更簡單。

(3) 用紫外分光光度法和酶標儀測定的結果相對偏差小，且采用酶標儀測定吸光度加標回收的回收率可達到96.9%，用酶標儀測定泛酸的吸光度值，耗時短，準確性高，故建議GB 5009.210—2016的后續修訂可在第一法中引入此方法測定吸光度值。

(4) 對于微生物法測定泛酸含量使用直接提取法導致結果偏高的原因還有待于深入研究，特別是如何避免和解決提取過程中因煙酸、生物素含量引起的結果偏高問題。