基于網絡藥理學探究冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創面愈合的作用機制

趙建偉 張文賢 林德民 嚴其凱 王守國 王世杰

[摘要]目的基于網絡藥理學方法探究冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創面愈合的作用靶點及信號通路，探索其作用機制。方法該研究利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）篩選冰清膏的活性成分和中藥靶標，使用蛋白質數據庫（Uniprot）進行基因名注釋，并在基因名片數據庫（GeneCards）中檢索“深Ⅱ度燒傷創面愈合”的相關疾病靶點，利用Cytoscape 3.8.2軟件，構建中藥-活性成分-靶點網絡，并采用蛋白質相互作用檢索數據庫（String）構建蛋白質相互作用網絡（PPI），利用生物信息分析數據庫（DAVID）進行潛在作用靶基因的基因功能富集分析（GO）及通路富集分析（KEGG）。結果篩選出冰清膏146個化合物和191個作用于深Ⅱ度燒傷的蛋白靶點，通過網絡拓撲特征評價篩選出25個冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創面愈合重要靶點;GO 分析顯示富集到生物學過程764個、細胞組分75個、分子功能149個;KEGG 通路富集篩選64條主要通路在促進深Ⅱ度燒傷創面愈合方面具有作用。結論通過網絡藥理學預測了冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創面愈合潛在的作用機制，為進一步的活性成分研究和實驗研究提供理論依據。

[關鍵詞]冰清膏;深Ⅱ度燒傷創面愈合;網絡藥理學;作用機制

[中圖分類號] R644? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）09-0023-05

Investigation on the mechanism of action of Bingqing Ointment in the promotion of deep second-degree burn wound healingbased on network pharmacology

ZHAO? JianweiWANG? Shijie1ZHANGWenxianLINDeminYANQikai1WANGShouguo1

1. Clinical College ofTraditional Chinese Medicine， Gansu University of Chinese Medicine， Gansu， Lanzhou 730000， China;

2. Emergency Orthopedics， Gansu Provincial Hospital ofTraditional Chinese Medicine， Gansu， Lanzhou 730000， China

[Abstract] Objective The targets， signaling pathways， and their mechanism of action of Bingqing Ointment in the promotion of deep second-degree burn wound healing were explored based on the network pharmacology method. Methods The active ingredients and traditional Chinese medicine targets of Bingqing Ointment were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform. The annotation for gene names was performed with the protein database Uniprot. The related disease targets of "deep second-degree burn wound healing" were searched in the GeneCards database. The TCM-active ingredient- target network was constructed by the Cytoscape 3.8.2 software. The protein-protein interaction was constructed by the protein interactions search database String. Gene ontology （GO） function enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of the potential target genes were carried out by using the biological information annotation database DAVID. Results A total of 146 compounds of Bingqing Ointment and 191 protein targets involved in the deep second-degree burn were screened out， and25 important targets of Bingqing Ointment for promoting deep second-degree burn wound healing were screened out based on the evaluation of network topology features. GO analysis showed that 764 biological processes，75 cellular components and 149 molecular functions were enriched.64 major pathways that function in the promotion of deep second-degree burn wound healing were screened by KEGG pathway enrichment analysis. Conclusion This study predicts the potential mechanism of action of Bingqing Ointment in the promotion ofdeep second-degree burn wound healing through network pharmacology， which provides a theoretical basis for further active ingredient research and experimental research.

[Key words] Bingqing Ointment; Deep second-degree burn wound healing; Network pharmacology; Mechanism of action

燒傷一般是指熱力因素引起的皮膚組織損傷，另外化學燒傷、輻射灼傷等發生的頻率也不斷增高[1]。深Ⅱ度燒傷傷及真皮乳頭層及部分網狀層，較多的組織失活，傷口愈合速度慢，容易引發感染[2]。目前臨床治療燒傷多采用藥物及各種物理療法，雖可取得一定療效，但創面愈合的效果仍不令人滿意。

冰清膏來源于民間驗方，由冰片、虎杖、大黃、黨參、黃芪、蒲公英、紫草、地榆以及雞蛋清組成，其功效主要為清熱活血、生肌去腐、解毒化瘀。臨床試驗中，在減輕患者疼痛，促進創面愈合方面有較好的效果（專利號：Z L201711075825.X）。為研究其作用機制，本課題組采用網絡藥理學方法，挖掘冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創面愈合的活性成分，預測其作用靶點及相關信號通路，探討冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創面愈合的作用機制，后期通過動物實驗進行驗證，以期為冰清膏的開發與利用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1中藥潛在化學成分數據的整理與篩選

在 TCMSP 中以類藥性（Drug-likeness， DL）≥0.18篩選冰片、大黃、黨參、地榆、虎杖、黃芪、紫草的潛在活性成分。同時通過文獻查閱匯總蒲公英與雞蛋清所有活性成分[3-4]，并通過SwissADME篩選其潛在活性成分。

1.2預測并構建成分靶點集

在 TCMSP 中搜索各活性成分對應的蛋白靶點，去重后獲得冰片、大黃、黨參、地榆、虎杖、黃芪、紫草的作用靶點。在Uniprot數據庫中將上述靶點經基因名稱轉換。蒲公英與雞蛋清經篩選成分從 PubChem 數據庫中搜集其 SMILE 結構式。利用SwissTargetPrediction數據庫預測成分靶點。利用Cytoscape 3.8.2生物信息分析軟件構建藥物成分-靶點網絡圖。

1.3深Ⅱ度燒傷的疾病靶點預測

在GeneCards數據庫中檢索關鍵詞“deep? second degree burn wound healing”，查詢與深Ⅱ度燒傷相關的基因，并篩選相關性分數（relevance score）≥1的基因，得到深Ⅱ度燒傷疾病靶點。

1.4冰清膏活性成分與深Ⅱ度燒傷的共同靶點篩選及PPI網絡的構建

將冰清膏靶點與深Ⅱ度燒傷靶點進行對比分析，以兩者交集作為冰清膏治療深Ⅱ度燒傷的作用靶點。在 String 網站中導入上述分析獲得的基因靶點，把物種設定為“Homo sapiens”，交互作用評分>0.4，獲得 PPI 結果。將該結果導入Cytoscape 3.8.2軟件中，通過 Analyze Network 進行拓撲分析，并按照自由度（Degree 值）大小篩選關鍵靶點。

1.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析

通過功能富集分析在線數據庫（DAVID）對關鍵靶點蛋白進行 GO 功能與 KEGG 通路富集分析，另外采用Cytoscape 3.8.2構建冰清膏治療深Ⅱ度燒傷靶點-KEGG 通路網絡圖，預測冰清膏對深Ⅱ度燒傷創面愈合的潛在作用機制。

2結果

2.1冰清膏候選化學成分信息及篩選結果

篩選共得到146種活性化學成分，經Uniprot基因名稱轉化后獲得靶點基因，將雞蛋清、蒲公英的活性成分的結構式導入SwissTargetPrediction獲取靶點基因，將所有結果匯總去重后共獲得427個作用靶點，采用Cytoscape 3.8.2構建“中藥-化學成分-作用靶點”網絡圖，見圖1，網絡圖中包含9個中藥節點，146個化合物節點，427個作用靶點節點和2474條邊。其中四邊形代表作用靶點，圓形代表中藥，六邊形代表活性成分。

2.2冰清膏治療深Ⅱ度燒傷靶點的篩選結果

在GeneCards數據庫中篩選出1125個疾病相關靶點，將冰清膏活性成分的預測靶點和深Ⅱ度燒傷相關靶點共同映射，尋找兩者共同靶點，結果共獲得191個共同靶點。

2.3蛋白質相互作用網絡（PPI）的構建和關鍵靶點篩選

通過 String 網站在線分析得到 PPI 網絡，將數據導入Cytoscape 3.8.2后共得到191個節點，4857條邊，經拓撲分析后節選 Degree ≥95的靶點作為冰清膏治療深Ⅱ度燒傷的核心靶點。結果構建的 PPI 網絡共有25個節點，199條邊，其中色彩越深，節點越大，Degree 值越高，相互作用越密切，見圖2。

2.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析結果

GO 富集分析顯示，生物學過程（biologial process， BP）分析結果764個;細胞組分（cellular component， CC）分析結果75個;分子功能（molecular fuction， MF）分析結果149個。見圖3。

KEGG 分析得到130個通路，篩選得到64條與深Ⅱ度燒傷有關的通路。通過微生信網站處理富集分析結果，其中，Y 軸代表通路名稱;X 軸代表富集因子;氣泡大小代表屬于這個通路的目標基因數量，顏色代表富集顯著性。見圖4。

2.5繪制“中藥復方-成分-靶點-通路-疾病”網絡圖

將 KEGG 分析結果整理后導入Cytoscape 3.8.2繪制“中藥復方-成分-靶點-通路-疾病”網絡圖。包括中藥復方1個，成分108個，靶點147個，通路64條，疾病1個。根據 Degree 值由高到低篩選核心成分、靶點以及通路，見圖5，圖中節點越大、顏色越深其作用越強。

3討論

本研究借助網絡藥理學手段，構建冰清膏的“成分-靶點-疾病”生物信息學網絡，初步探究該藥促進深Ⅱ度燒傷創面愈合的相關機制?，F代藥理學研究發現冰清膏中組分主要具有抑菌抗炎、調節微循環、抗氧化、促進免疫功能調節、促進傷口愈合等作用。

本研究篩選得到的冰清膏中108個具有促進深Ⅱ度燒傷創面愈合的化合物，部分成分的有效性已被證實，根據圖5可知槲皮素（MOL000098）、芹菜素（MOL000098）、大黃素（MOL000472）等是關鍵活性成分。研究顯示，槲皮素具有抗炎抑菌及抗氧化等多種生物活性[5]，此外槲皮素可使 IL-1、IL-6、 IL-10等炎癥因子的表達量降低[6]，抑制 p38/MAPK 通路相關因子的表達而達到抗炎效果[7]。芹菜素可上調表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）、堿性成纖維細胞因子（basic fibroblast growth factor， b-FCF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表達[8]，能夠顯著提高抗氧化酶活性并降低 TNF-α、IL-1β、IL-6含量，從而促進深Ⅱ度燒傷創面愈合[9]。大黃素具有抑菌抗炎、抗病毒、抗氧化、穩定內環境等多種功能[10]，能促進 EGF、 VEGF 表達，皮膚表皮細胞及毛細血管生成，有助于傷口愈合[11]。

蛋白質相互作用網絡分析得到的 AKT1、IL-6、 TNF、VEGFA、LI-1β等核心靶點蛋白均與炎癥、血管生成、生長因子有關，均被大量研究所證實，這可能是深Ⅱ度燒傷創面愈合的重要作用靶點。AKT1是腫瘤血管成熟、細胞外基質組成和血管生成的關鍵調節劑，在生長因子和細胞因子的刺激下被激活，是創面愈合過程中血管生成及成熟所必需的成分[12]。IL-6具有促炎和抗炎作用，用以激活免疫反應，尤其是燒傷或其他損傷導致的炎癥。TNF-α和 IL-1β會抑制轉化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）誘導的 p38/MAPK 通絡的激活，導致神經生長因子（nerve growth factor， NGF）表達的降低，從而延緩傷口的愈合[13]。 VEGFA 是 VEDF 家族中的一員，具有促進新生血管形成和增加血管通透性的能力。

另外冰清膏候選作用深Ⅱ度燒傷靶基因 KEGG 顯著富集通路涉及 TNF 信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、PI3K/AKT 信號通路、MAPK 信號通路等。目前研究表明，TNF 介導了機體內廣泛的細胞反應，包括凋亡、炎癥、免疫反應等，可引發多種下游通路[14]。HIF-1是與缺氧適應及炎癥發展等密切相關的因子，曾勇等[15]研究發現 HIF-1α可以在 p38/MAPK 與 PI3K 的共同作用下上調 VEGF 的表達，從而刺激血管再生，加快創面愈合速度。FoxO參與細胞代謝、增值、遷移、凋亡和血管生成的進展[16]，PI3K/AKT 是FoxO的上游靶點，其具有抑制細胞凋亡，參與控制細胞生長和增殖[17]，還對血管生成有促進作用[18]，李為明等[19]研究顯示 PI3K/AKT 通路可以影響 IL-1β、TNF-α與 TGF-β的表達，并下調 HIF-1α使創面愈合得到加速。另外有研究顯示 MAPK 信號通路的級聯被認為是誘導大鼠燒傷皮膚組織炎癥的核心信號通路[20]。各種原因導致 p38/MAPK 的高表達，會誘發炎癥因子 TNF-α、IL-1β及 IL-6異常分泌而加重炎癥反應。阻斷 p38/MAPK 通路活化則會介導全身炎癥反應水平更快下降?？梢酝茢喑?p38/MAPK 是炎癥反應中一條重要通路，在創面愈合也扮演重要角色[21]。因此，冰清膏可能在炎癥、細胞生長與增殖、血管生成等方面發揮作用，從而促進深Ⅱ度燒傷創面愈合。

綜上所述，本研究利用中藥網絡藥理學的方法，在理論上初步對冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創面愈合的作用機制進行了系統分析。結果證實了中藥治療疾病多成分、多靶點、多通路的特點，為后續冰清膏進一步的藥理機制分析和實驗研究提供了理論支持。但中藥復方個味中藥的劑量，并通過炮制、煎煮等過程，其藥效成分發生變化，藥理作用也不單是僅通過網絡藥理學分析就可得出結論，因此，后續需要對本研究結果在藥物實驗以及臨床應用中加以驗證。

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（收稿日期：2021-10-12）