福建大頭蛙抗癌多肽FJ-2945抗腫瘤活性研究

林婷婷，廖偉堅，林平發，潘雪豐

(福建衛生職業技術學院藥學院，福建 福州 350101)

0 引言

惡性腫瘤是威脅人類健康的疾病之一，在全球范圍內的發生率和死亡率呈逐年上升的趨勢[1]. 其中，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床中最常見的肝臟惡性腫瘤亞型，導致HCC發病的主要因素有酗酒、乙肝病毒感染以及代謝性疾病等[2]. 我國每年新增的HCC患者約占全球每年新增病例的50%，屬于我國高發性腫瘤[3]，給我國公共衛生系統帶來巨大威脅. 對于進展期HCC患者，臨床上通?？刹捎檬中g切除病灶、肝移植、射頻消融及經導管肝動脈化療栓塞等治療方案. 然而早期HCC沒有特征性臨床表現，難以被及時診斷并進行治療，多數患者初診即為中晚期腫瘤并伴隨癌細胞轉移. 針對這類患者，分子靶向藥物例如酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)能取得一定的治療效果，但長期使用一、二代TKIs依然伴隨著獲得性耐藥等問題[4-5]，阻礙了HCC的治療效果. 因此探索療效顯著且毒副作用小的抗腫瘤藥物，是改善肝細胞癌患者生活質量、延長生存期的必然要求.

多肽通常由10～100個氨基酸分子脫水縮合，其廣泛存在于動植物、真菌及細菌等生物體內. 在無尾兩棲類的皮膚分泌液中發現多種具有抗腫瘤活性的多肽，其均具有正電性、疏水性和兩親性等特性, 可與帶有陰離子的腫瘤細胞膜產生選擇性[6]. 同時，生物活性肽具有抑制細胞增殖、抗微管蛋白聚合、細胞毒性等功能，呈現出抗癌潛能[7]. 國內外學者已從兩棲類動物的皮膚分泌物中分離獲得數百種生物活性分子，也陸續發現了一系列具有抗腫瘤活性的多肽. 研究發現，蟾蜍皮膚提取液中的Bufadienolides、多肽和生物堿，具有抗癌的藥理活性[8]，印度蟾蜍皮膚水提液中細胞毒蛋白(BMP1)對癌細胞具有抑制增殖和凋亡的活性[9]，一些具有抗菌活性的天然肽(magainin II，蛙皮素II)也具有殺瘤的作用[10]，福建大頭蛙皮膚分泌物中提取的抗菌多肽 LFB 同時具有抗癌的活性[11]. 臨床上使用的華蟾素注射液在治療原發性肝癌、中晚期肺癌等惡性腫瘤中取得良好的療效，也證實了蛙類分泌物可作為潛在治療癌癥的新藥物來源[12].

本課題對福建本土自然資源福建大頭蛙(Limnonectesfujianensis)皮膚分泌物中含有的多肽進行分離分析，從中發現多肽FJ-2945具有抑制肝癌細胞增殖、遷移和促進細胞凋亡的作用，通過系統研究其體外的抗腫瘤活性，初步探討其抗腫瘤作用機制，為抗腫瘤多肽FJ-2945的臨床前研究提供理論基礎以及實驗依據.

1 材料與方法

1.1 材料

Hep3b購自上海細胞生物研究所； DMEM培養基購自上海HyClone公司； FBS購自鄭州博賽生物技術股份有限公司； RNA提取試劑盒，逆轉錄試劑盒購自諾唯贊生物技術有限公司； 引物序列由上海生工公司合成； CCK8試劑盒、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、分子量標準彩色預染蛋白(15～120 ku)等購自碧云天生物技術有限公司； Skp2、p21、p27、E-cadherin和N-cadherin蛋白抗體購自上海Cell Signaling Technology公司； cyclin A2與二抗購自上海Santa Cruz公司.

1.2 方法

1.2.1蛙皮多肽序列與cDNA序列鑒定

蒸餾水沖洗蛙皮，釆用電刺激法(10 V，20 Hz)點式刺激背部，待產生白色沫狀物質即用去離子水沖洗分泌物，并將所得分泌物溶液高速離心后冷凍干燥，保存于-20 ℃冰箱備用. 將5 mg凍干的福建大頭蛙蛙皮分泌物重新溶解后離心收集上清液，通過 RP-HPLC對蛙皮中的組分以1 mL·min-1的流速進行總計240 min的梯度洗脫. 初始流動相為TFA/H2O (0.05/99.95, 體積比)，終止流動相為TFA/ACN/H2O (0.05/80/19.95, 體積比). 洗脫過程中持續監測柱流出物在λ=214 nm 處的吸收峰，并使用自動收集餾分收集洗脫組分. 洗脫組分使用 LCQ-Fleet電噴霧離子阱質譜儀通過 MS/MS碎片測序確定洗脫組分中FJ-2945的氨基酸序列. 根據上述步驟得到的FJ-2945的氨基酸序列設計簡并引物，通過5‘-RACE 和3’-RACE法得到包含完整閱讀框的編碼相應活性多肽的 cDNA 序列，通過與在線多肽數據庫(NCBI-Blast)對比確認FJ-2945成熟肽序列后，最后委托上海生工公司通過固相蛋白質合成系統合成FJ-2945，合成多肽純度達98%以上，置于-20 ℃保存并用于后續功能試驗研究，臨用前用細胞培養基配制成所需濃度.

1.2.2細胞培養

將Hep3b細胞培養在完全培養基DMEM (10%FBS+1%P/S，體積分數)中，置于37 ℃、5% (體積分數)CO2細胞培養箱中進行常規傳代培養.

1.2.3CCK8實驗

將對數生長期的Hep3b細胞消化離心后稀釋至8 000個/孔的密度接種到96孔板中，置于孵箱中培養12 h 后，待細胞貼壁后，在實驗組中加入不同終濃度(1、10、100 nmol·L-1和1、10、20、40、80、160 μmol·L-1)的多肽FJ-2945，每組設5個復孔，繼續培養24 h，隨后每孔加入10 μL的 CCK8試劑，繼續孵育2 h后在450 nm處測定吸光度并計算相對抑制率.

1.2.4RTCA技術

將對數生長期的Hep3b細胞消化離心后稀釋至3 000個/孔的密度接種至實時無標記細胞分析儀檢測盤(E-Plate)中，連續監測76 h，每1 h記錄一次. 種盤12 h后，取出E-Plate，實驗組加入100 μL終濃度為1、2 μmol·L-1FJ-2945的培養基，對照組加入等體積含有PBS的培養基并繼續培養至監測結束，試驗結束后，記錄實時傳輸數據并繪制細胞生長情況.

1.2.5WoundHealing劃痕實驗

將 Hep3b細胞以90%密度接種于6孔板中，待細胞充分貼壁后，用10 μL槍頭垂直于皿底制造劃痕，每制造一條劃痕換一次槍頭，隨后用 PBS洗3次，實驗組加入100 μL終濃度為1 μmol·L-1FJ-2945的培養基，對照組加入等體積含有PBS的培養基，置于恒溫孵箱培養24 h，分別在孵育0、12、24 h顯微鏡下拍照記錄劃痕的愈合情況.

1.2.6Transwell實驗

將Hep3b細胞用無血清培養液處理24 h后，實驗組加入100 μL終濃度為1 μmol·L-1FJ-2945的培養基，對照組加入等體積含有PBS的培養基，繼續培養24 h，消化離心，無血清培養基重懸細胞，按4×105個/孔的密度接種于小室中，下室加入500 μL含10%(體積分數)FBS的培養基，置于恒溫孵箱中培養24 h，取出小室清潔并加入1 mL 4%(體積分數)多聚甲醛固定15 min，棄固定液，倒置風干后，PBS洗3次，0.1%(體積分數)結晶紫染色15 min，棄染色液，PBS洗3次，顯微鏡觀察拍照，隨機選取3個細胞均勻穿膜的視野統計并比較對照組與實驗組的穿膜細胞數量.

1.2.7細胞周期檢測

將對數生長期的Hep3b細胞以50%～60%的密度接種至6 cm培養皿中，貼壁培養后，實驗組加入100 μL終濃度為1、2 μmol·L-1FJ-2945的培養基，對照組加入等體積含有PBS的培養基繼續培養24 h，胰酶消化離心后，PBS 清洗2次，隨后加入預冷的70%(體積分數)乙醇固定過夜，離心棄去上清液，PBS清洗1次，加入PI/RNase染色緩沖液室溫避光染色30 min，隨后流式細胞儀檢測細胞熒光，觀察細胞周期分布.

1.2.8qRT-PCR實驗

實驗組加入100 μL終濃度為1、2 μmol·L-1FJ-2945的培養基，分別用實驗組1、2表示； 對照組加入等體積含有PBS的培養基，培養24 h后，使用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，測定濃度后，進行逆轉錄反應獲得cDNA，隨后將cDNA 模板與Master Mix、待測基因的正向引物和反向引物混合的反應體系進行qRT-PCR反應，以檢測目的基因mRNA表達情況的變化.

1.2.9WesternBlotting實驗

實驗組加入100 μL終濃度為1、2 μmol·L-1FJ-2945的培養基(實驗組1、2)，對照組加入等體積含有PBS的培養基，培養24 h后，消化并收集細胞，提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，采用上樣緩沖液(5×)將樣品稀釋至20 μg·μL-1. 將等量的細胞蛋白通過SDS-PAGE凝膠分離并濕轉至PVDF膜，用脫脂牛奶封閉 1 h，加入一抗(1∶3 000，體積比)4 ℃孵育過夜，TBST清洗殘余一抗后，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌，最后在PVDF膜上滴加發光液進行發光檢測.

1.2.10統計學分析

使用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計學分析，計量資料用平均值±標準差(x±s)表示，組間均數比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義.

2 實驗結果與分析

2.1 FJ-2945的多肽序列與 cDNA 序列鑒定

圖1(a)為RP-HPLC梯度洗脫結果曲線. LCQ-MS/MS 鑒定#121洗脫峰中含有相對分子質量為2 945的多肽組分，通過在線多肽序列分析工具預測得到的的FJ-2945碎片化單電荷和雙電荷 b-ion和片段的分子質量表，質譜中檢測到的b-ion碎片用紅色字體標記，而y-ion用藍色標記，驗證其多肽一級序列為TLKNLAKTAGKGALQSLLNHASCKLSGQC(見圖1(b)). 測序得到FJ-2945的開放閱讀框 cDNA(見圖1(c))，與數據庫(NCBI-Blast)對比確認FJ-2945成熟肽序列，說明蛙皮中存在編碼FJ-2945的核苷酸序列，應用 SWISS-MODEL 多肽二級結構預測軟件預測得到FJ-2945多肽具有兩親性的α螺旋二級結構(α-Helix)(見圖1(d)). 根據文獻報道，兩親性的α螺旋多肽常具有抗菌與抗腫瘤增殖作用[13].

圖1 FJ-2945分離與結構鑒定Fig.1 Isolation and structure identification of FJ-2945

2.2 FJ-2945對Hep3b細胞生長與增殖的抑制作用

CCK8實驗結果表明，多肽FJ-2945呈劑量依賴性的抑制Hep3b細胞的增殖過程，其半數抑制濃度(IC50)為(1.87±0.499)μmol·L-1(見圖2(a)). 隨后，通過RTCA技術同樣驗證多肽FJ-2945對Hep3b細胞的增殖呈劑量依賴性的抑制作用，在細胞培養76 h后，實驗組中Hep3b細胞增殖速度顯著低于對照組，接種2 μmol·L-1FJ-2945的實驗組2細胞總量僅為對照組細胞的50%，實驗組1細胞總量為對照組細胞的83%，表明FJ-2945對Hep3b細胞的生長增殖具有較強的抑制作用(見圖2(b)).

圖2 FJ-2945對Hep3b細胞增殖的影響Fig.2 Effect of FJ-2945 on the proliferation of Hep3b cell

2.3 FJ-2945對Hep3b細胞周期分布的影響

流式細胞儀檢測結果表明，實驗組中Hep3b細胞呈現細胞周期G1/S期阻滯，并以2 μmol·L-1多肽FJ-2945 (實驗組2)的作用更為顯著(見圖3(a～c)). 如圖3(d)統計圖中所示，經1、2 μmol·L-1多肽FJ-2945處理后，G0/G1期細胞數量提高至66.8%、70.9%，相比對照組60.7%有不同程度的提高. 此外，經過2 μmol·L-1FJ-2945處理后，處于sub-G1期的細胞數量由對照組中的5.12%提高到10.95%，說明FJ-2945可能同時誘導細胞凋亡.

圖3 FJ-2945對Hep3b細胞周期的影響Fig.3 Effect of FJ-2945 on the cell cycle of Hep3b

2.4 FJ-2945對Hep3b細胞遷移的影響

劃痕實驗和Transwell實驗檢測多肽FJ-2945對Hep3b遷移能力的影響. 為避免因高濃度FJ-2945造成的細胞殺傷作用導致假陽性結果，選擇1 μmol·L-1的FJ-2945處理細胞，分別在處理后0、12、24 h進行拍照記錄. 結果如圖4(a)所示，實驗組中Hep3b細胞遷移速率明顯低于對照組. 對照組在劃傷24 h后劃痕基本愈合，而實驗組仍保留劃痕，證實了多肽FJ-2945能明顯抑制Hep3b細胞的遷移. Transwell結果如圖4(b)所示，每個單獨視野中實驗組Hep3b細胞穿過至下室的細胞數量為(40±7)個，與對照組(83±4)個相比，差異具有統計學意義(***表示P<0.001)，提示FJ-2945能抑制Hep3b細胞的遷移能力.

圖4 FJ-2945對Hep3b細胞遷移能力的影響Fig.4 Effect of FJ-2945 on the cell migration of Hep3b

2.5 FJ-2945抗腫瘤機制研究

通過qRT-PCR檢測細胞增殖、細胞周期相關因子E2F1、Skp2、CDK4、CCNA2、CDKN1B和細胞遷移相關因子Slug、Snail、E-cadherin、N-cadherin的變化，結果如圖5(a)所示. 實驗組中與細胞周期進展相關的基因如Skp2、E2F1、CCNA2、CDK4均沒有發生顯著變化，細胞遷移相關的基因Slug與Snail水平顯著降低(*表示P<0.05, *** 表示P<0.001)，CDKN1B、E-cadherin的mRNA水平顯著上升(***表示P<0.001)，說明多肽FJ-2945并非從轉錄水平上影響細胞周期相關因子，但是對細胞遷移調控因子E-cadherin、Slug與Snail則具有顯著影響.

Western blotting實驗結果如圖5(b)所示，實驗組中Skp2、Cyclin A蛋白的表達顯著下降. 有研究報道細胞中Skp2含量降低會導致細胞增殖抑制并誘導細胞凋亡[14]，或解釋了FJ-2945的主要抗腫瘤分子靶標. 另一方面，實驗組中Skp2靶蛋白p27含量則顯著上升. 據文獻報道，Skp2介導p27周期性的泛素-蛋白酶體降解，使p27釋放Cyclin A 或Cyclin E/Cdk2復合物的抑制狀態，從而允許細胞通過 G1/S 期[15]. 這些結果可能說明FJ-2945是通過降低 Skp2在肝癌細胞中的蛋白含量，從而抑制了由Skp2介導的下游靶蛋白p27泛素-蛋白酶體降解過程，該結果導致細胞周期蛋白p27在細胞中積累并抑制CDK-cyclin復合體，從而造成細胞周期G1/S 期阻滯[16]. 此外，實驗組中細胞錨定蛋白E-cadherin表達量升高而促進細胞遷移的N-cadherin表達量降低, 則說明FJ-2945可能通過抑制癌細胞上皮間質轉換(EMT)轉變，從而降低肝癌細胞的遷移能力[17].

圖5 FJ-2945抗腫瘤機制研究Fig.5 Anti-cancer mechanism study of FJ-2945

3 討論

我國肝癌的發病率在惡性腫瘤中位居第四位，死亡率位居第二位，并且肝癌是所有腫瘤中預后最差的腫瘤[18]. 肝癌的診治水平可以提高患者的生存率，除了傳統化療藥物，加快研發新型的藥物尤為重要. 國內外已發現蛙類皮膚腺分泌物中部分抗菌、抗腫瘤等生物活性成分[11, 19-20]，且由于蛙皮活性多肽的相對分子質量小、特異性強、毒性小等特點一直被認為是極具潛力的新型抗腫瘤藥物的研究對象，但其抗腫瘤的機制多樣且尚未被徹底明確限制了其抗腫瘤的研究進展[21]. 福建大頭蛙(Limnonectesfujianensis)屬于福建省武夷山地區的兩棲動物優勢種，其皮膚腺體分泌物含有大量的多肽類活性物質，本課題組從福建大頭蛙皮膚分泌物中分離并鑒定新型活性多肽FJ-2945的氨基酸與cDNA序列，并使用合成的FJ-2945多肽進行抗腫瘤活性與抗腫瘤機制研究.

本研究結果表明，多肽FJ-2945能夠抑制Hep3b細胞的生長增殖、遷移與凋亡，表明多肽FJ-2945對肝癌細胞Hep3b抑制作用以及潛在的治療價值. 在抗腫瘤機制方面，本研究明確了多肽FJ-2945通過降低細胞內Skp2蛋白含量造成p27蛋白在胞內累積，從而造成細胞周期的G1/S 期阻滯，最終抑制Hep3b細胞增殖. 根據文獻報道，在細胞增殖過程中，Skp2通過降解p27促進細胞周期G1/S期轉換，而在細胞遷移過程中，Skp2蛋白的高表達被認為與腫瘤增殖與遷移呈正相關，其機制主要與胞質Skp2誘導的細胞錨定蛋E-cadherin的過度降解有關[22-24]. 本實驗抗腫瘤機制初步研究結果表明，多肽FJ-2945極有可能是通過影響細胞中Skp2的蛋白質表達，從而影響Skp2的下游因子如p27、E-cadherin等，最終抑制肝癌細胞的增殖與遷移能力.

綜上所述，多肽FJ-2945具有顯著的抑制Hep3b細胞增殖、遷移的作用，并誘導Hep3b細胞凋亡的抗腫瘤活性，但同時與其他多肽類物質一樣也具有易水解、穩定性差與靶向性不強等缺點，因此需要在此基礎上對多肽FJ-2945進行結構改造，以期進一步提升其穩定性與抗腫瘤活性，通過臨床前實驗更深入研究FJ-2945抗腫瘤作用機理，挖掘其臨床應用的潛力.