艾炷灸對CTX骨髓抑制大鼠模型外周血及肝功能的影響

譚 麗，謝 煜，陳洪達，王 寧*

(1.深圳市龍華區中心醫院，廣東 深圳 518110；2.廣東省中醫院，廣東 廣州 510120；3.中山大學附屬第七醫院，廣東 深圳 518107)

艾灸是傳統中醫藥外治法的一種，在防病治病方面已有數千年歷史，現代實驗研究證實艾灸可以提高機體免疫功能。臨床研究發現，艾灸足三里可以治療化療后骨髓抑制狀態[1-2]。骨髓抑制是腫瘤化療后常見的不良反應，據統計80%患者在腫瘤化療過程中均會出現骨髓抑制，對免疫系統及造血功能影響最為明顯，其中白細胞減少最為突出，嚴重影響免疫系統功能，臨床常出現嚴重的感染、出血等癥狀[3]。改善化療后的骨髓抑制在治療腫瘤中具有積極作用。因此，本研究采用環磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)溶液建立穩定的骨髓抑制模型[4-7]，選擇不同灸量的艾炷灸干預骨髓抑制大鼠模型，觀察其對大鼠模型外周血細胞及肝功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級SD 雄性大鼠30只(購于南方醫科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK(粵)2016-0041)，體質量為(200±20) g。將30只SD大鼠飼養于中國中醫院科學院廣東分院SPF級動物房，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～70%，飼養環境清潔、安靜。喂養7天后，采用SPSS軟件的隨機數生成功能將大鼠隨機分為5組，每組6只大鼠，即對照組、模型組、艾灸1組、艾灸2組、艾灸3組。對照組正常飼養，不予干預。

1.2 藥物及儀器

藥品：環磷酰胺：5 g/瓶(H20160467，公司：德國Baxter Oncology GmbH)；滅菌注射用水。溶液配制：稱取500 mg CTX，溶于50 mL滅菌注射用水，震蕩后完全溶解，配置成10 mg/mL的CTX溶液，現配現用。儀器：邁瑞獸用全自動血液細胞分析儀，型號：BC-2800vet。艾絨：陳艾絨(35∶1)，250 g/包(北京國醫研醫藥技術開發有限公司，企業標準：Q/DGYY 0001-2017)。

1.3 模型建立與干預

模型建立：模型組和艾灸組從造模開始，各組大鼠每天同一時間段行腹腔注射CTX溶液(劑量40 mg/kg)，1次/天，連續 5 天。根據前期研究，造模第5天骨髓抑制模型成立。當模型建成后，采用原劑量減半(20 mg/kg)且隔天注射的方法，維持到造模第13天，停止藥物注射。

選穴與治療：大鼠穴位的選取根據《實驗針灸學》，足三里穴：位于大鼠后肢膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm 處。為了保證每個艾炷的體積相當，將艾炷做成直徑3 mm、高3 mm的圓錐形艾炷。將大鼠穴區1.5 cm×1.5 cm范圍內的鼠毛剃掉，暴露皮膚。造模第6天開始艾灸，將做好的艾炷放置于施灸的穴位上，穴位上涂醫用凡士林，然后用線香點燃，待艾炷燃至大鼠掙扎時，用鑷子迅速更換艾炷，從左側足三里穴開始，再到右側足三里穴。艾灸1組每穴 3壯/次，艾灸2組每穴 6壯/次，艾灸3組每穴 9壯/次，每日1次，連續灸7天。

1.4 指標采集及檢測

各組在造模第5、13天對大鼠尾巴用75%酒精消毒，進行尾靜脈取血，棄掉第一滴血，然后滴入2支加有5%EDTA抗凝EP管，各收集1.5 mL，混勻后采用全自動血液細胞分析儀對各組大鼠尾靜脈外周血中白細胞(White blood cell，WBC)、淋巴細胞(lymphocyte，Lym)、單核細胞(Monocyte，Mon)/中性粒細胞(Granulocyte，Gra)、紅細胞(Red blood cell，RBC)、血紅蛋白(Hemoglobin，Hb)、血小板(Platelet，PLT) 數量進行檢測。另一支EP管中的血靜置2 h后，離心15 min，轉速為3 500 r/min。離心后取250 μL血清裝入凍存管，用ELISA法觀察大鼠谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)含量變化，了解造模及艾灸對肝臟的影響。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 造模完成后各組大鼠外周血細胞變化

造模完成后各組大鼠外周血WBC、Lym、Mon、Gra含量均低于對照組(P<0.05)，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；各組大鼠外周血PLT均降低，其中艾灸1組、艾灸2組與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，模型組與艾灸3組差異無統計學意義(P>0.05)；外周血Hb均降低，其中艾灸1組與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、表2。

表1 造模完成后各組大鼠外周血細胞含量比較

表2 造模完成后各組大鼠外周血PLT的Kruskal-Wallis 檢驗

2.2 艾灸治療后骨髓抑制大鼠模型外周血細胞含量變化

艾灸治療后，艾灸各組大鼠外周血WBC及Lym成上升趨勢，其中艾灸2組、艾灸3組的外周血WBC、Lym較模型組相比差異有統計學意義(P<0.05)，艾灸1組的外周血WBC、Lym與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)；艾灸各組外周血Mon、Gra、PLT呈上升趨勢，但與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后外周血RBC、Hb未見明顯上升。詳見表3。

表3 艾灸后各組大鼠外周血細胞含量的組間比較

2.3 骨髓抑制模型大鼠艾灸前后外周血細胞含量變化

艾灸治療后，艾灸1組大鼠外周血Mon的含量較治療前明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)，其中外周血RBC、PLT較前有上升趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；艾灸2組的大鼠外周血WBC、Lym、Mon含量較治療前明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)，其中外周血Gra、RBC、PLT較治療前上升，差異無統計學意義(P>0.05)；艾灸3組大鼠外周血WBC、Lym、PLT的含量較治療前明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)，其中外周Mon、Gra較前有上升趨勢，差異無統計學意義(P>0.05)；模型組在造模第13天，大鼠外周血Hb較前下降，差異有統計學意義(P<0.05)。其余指標無差異。詳見表4。

表4 骨髓抑制模型大鼠艾灸前后外周血含量的獨立樣本檢驗

2.4 艾灸對骨髓抑制模型大鼠肝功能的影響

艾灸治療后，模型組與對照組相比，大鼠血清ALT、AST均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；艾灸1組大鼠血清ALT、AST較模型組比均下降，其中AST含量與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；艾灸2組與艾灸3組大鼠的AST含量較對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而ALT含量較模型組下降，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5和圖1。

表5 各組大鼠艾灸后血清ALT、AST含量變化

圖1 艾灸后各組大鼠外周血細胞組間比較

3 討論

CTX作為臨床中常用的烷化劑化療藥，在建立骨髓抑制模型方面主要因其效果穩定、較易獲得、成本不高而廣泛推廣，而其造成的骨髓抑制的機制主要是通過破壞骨髓造血干細胞DNA，造成造血細胞的不規則壞死、凋亡，引起造血前體細胞的活性下降，出現骨髓抑制[8-10]。但停止造模后，模型組外周血可逐漸恢復正常。因此采用常規造模劑量結合維持劑量聯合造模才能保持模型的穩定性。本實驗結果提示，常規40 mg/kg劑量結合20 mg/kg隔天維持劑量可以很好地維持模型的穩定性，在造模第13天仍能維持與造模第5天同一水平的指標，但Hb較剛開始造模有所下降，考慮與紅細胞凋亡時間較長有關。

艾灸作為一種中醫特色療法，具有溫陽散寒、活血化瘀、調和氣血、協調陰陽、扶正祛邪的作用，現廣泛應用于臨床，主要包括直接灸(艾炷灸)和間接灸。而臨床中發現艾炷灸在治療化療后白細胞減少及改善患者生活質量方面的效果要優于其他灸法[11]。根據1985-2018年艾灸治療骨髓抑制的經穴頻次分析，發現臨床使用頻次最高的穴位為足三里[12-13]。足三里穴為胃經的合穴，屬“土穴”，能夠補益本經的氣血，自古被認為是補益的要穴，如《靈樞》：“陰陽俱有余，若俱不足，則有寒有熱。皆調于足三里”，《通玄指要賦》：“三里卻五勞之羸瘦”?？梢娮闳锸侵巍疤搫凇钡囊?，不僅可以補益后天之本，促使氣血生化，更可益氣補虛，改善腫瘤患者的“本虛”狀態。因此本研究采用艾炷灸作為干預方法，足三里穴為施灸穴位。

實驗結果表明，艾炷灸可以升高骨髓抑制模型大鼠外周血白細胞含量，主要以升高淋巴細胞為主，而且隨著艾炷的壯數增加，升高白細胞數量的差異越來越明顯。白細胞為機體中重要的免疫細胞，艾灸可明顯升高淋巴細胞，主要以T淋巴細胞為主，可調節外周血中CD3+、CD4+、CD8+T細胞的含量，提高充分免疫應答效應[14-15]。相關研究表明[16-18]，艾灸可以通過促進骨髓細胞周期蛋白以及修復基因的表達，增強細胞 DNA 的合成，提高化療后骨髓基質細胞支持造血的能力及血清集落刺激因子的活性，促使造血干/祖細胞增殖。而艾炷灸對皮膚的燒灼可以激發炎癥組織對熱休克蛋白(HSPs)的大量表達，進而抑制IL-1、TNF-α等炎癥因子的表達[19-20]。因此，筆者認為艾炷灸可能通過炎癥介導的相關機制激發免疫應答、促進骨髓造血細胞的增殖與遷移。

ALT、AST為評價肝細胞損傷的有效指標，ALT與藥物中毒性肝細胞壞死相關。CTX在應用中發現可致肝損傷，表現為血清轉氨酶、膽紅素等指標升高，其損傷機制可能與氧化應激有關，主要降低正常小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)的活力，升高丙二醛 (MDA)含量[21]。在骨髓抑制模型的建立中可以發現，肝臟ALT、AST含量均明顯升高，但經艾炷灸治療后，ALT下降，而AST無明顯變化，由于AST主要分布于心肌，其次是肝臟、骨骼肌等組織中，說明艾炷灸并沒有加重肝細胞損傷，而且在一定程度上可減輕肝細胞損傷。

綜上所述，艾炷灸可以減輕CTX骨髓抑制大鼠模型的骨髓抑制狀態，以升高CTX骨髓抑制大鼠模型外周血WBC、Lym細胞的含量為主。在本實驗中，艾炷灸的灸量與外周血細胞的升高存在一定的相關性，且在治療過程中艾炷灸未加重模型大鼠肝細胞損傷。