冬蟲夏草提取物及核苷酸類成分對堿性磷酸酶的抑制活性研究

張 浩，李文佳，黃 琦，錢正明，楊豐慶*

(1.重慶大學 化學化工學院，重慶 401331；2.宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司，湖北 宜昌 443000)

堿性磷酸酶(ALP)是一種金屬蛋白酶，在蛋白質、核酸或小分子去磷酸化過程中不可或缺[1-2]。ALP在細胞內調節蛋白質活性和信號通路中也發揮著重要作用。通常，有兩種類型的ALP同工酶，包括存在于生殖細胞(GCAP)、腸道(IAP)和胎盤(PLAP)[3]中的組織特異性ALP，以及主要存在于肝臟、骨骼、中樞神經系統和腎臟等多種組織中的非特異性ALP(TNAP)。目前，ALP已被證實為許多疾病的重要生物標志物，如肝病[4]、老年癡呆[5]、膽道梗阻[6]、前列腺癌骨轉移[7]和血管礦化[8]等。因此，開發TNAP抑制劑是治療焦磷酸鹽代謝障礙的一種潛在方法。

冬蟲夏草為我國傳統名貴中藥材，2020版《中華人民共和國藥典》規定冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordycepssinensis(BerK.) Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體，具有補腎益肺、止血化痰之功效[9]?，F代研究發現，冬蟲夏草化學成分復雜，主要藥效成分包括核苷、多糖、甘露醇、麥角甾醇、氨基酸、脂肪酸等[10]，具有抗衰老、抗氧化、提高機體免疫力的作用，對心腦血管疾病、呼吸道系統疾病、肝腎疾病等也具有良好的治療效果[11-12]，探究冬蟲夏草提取物和主要核苷酸類成分對ALP的抑制作用具有重要意義。因此，本文評價了27個冬蟲夏草水提物和5個核苷酸成分的ALP抑制活性，以期為蟲草類藥材治療疾病及加工提供參考。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

小牛腸堿性磷酸酶(EC 3.1.3.1)(上海源葉生物科技有限公司，批號：M26N11Y127666)；4-硝基苯磷酸二鈉鹽(p-NPP)(北京索萊寶科技有限公司，批號：7031021)；腺苷5′-單磷酸二鈉鹽(阿達瑪斯試劑有限公司，批號：P1626447)；尿苷5′-單磷酸二鈉鹽(阿達瑪斯試劑有限公司，批號：P03930)；胞苷5′-磷酸二鈉鹽(阿達瑪斯試劑有限公司，批號：P03925)；鳥苷-5′-單磷酸二鈉鹽(上海邁瑞爾化學技術有限公司，批號：787171170)；胸苷-5′-單磷酸二鈉鹽(上海西格瑪奧德里奇試劑有限公司，批號：061M1420V)；鹽酸(成都科隆化學品有限公司，批號：2020040801)；三(羥基甲基)氨基甲烷(Tris)(成都科隆化學品有限公司，批號：20191216)。天然冬蟲夏草樣品采集自西藏那曲、四川和青海。所有人工培植冬蟲夏草均為宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司提供。所有樣品均存放于重慶大學化學化工學院制藥工程實驗室。

實驗過程中所使用的儀器包括FE 28 pH計(梅特勒-托利多國際有限公司)、超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司)、UV-5500 PC紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)、SHZ-82恒溫振蕩器(江蘇常州金壇城西崢嶸實驗儀器廠)、CP411-1料理機(廣東德爾電器有限公司)、研磨機(IKA TUBE-MILL 100 control，德國，艾卡(廣州)儀器設備有限公司(IKA中國))、烘箱(Binder ED115，德國Binder公司)，以及ATSgene18 20A基因型超純水機(重慶市安特生環保設備有限公司)。

1.2 冬蟲夏草樣品和溶液制備

采用Tris-HCl緩沖液(10.0 mM，pH=8.0)制備酶活性為0.6 U/mL的ALP溶液。采用Tris-HCl緩沖液(10.0 mM，pH=8.0)制備濃度為0.8 mmol·L-1的p-NPP。濃度為10.0 mmol·L-1的5個核苷酸類小分子化合物分別溶解在10.0 mmol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)中。

采用沸水提取法制備冬蟲夏草水提取物。稱取0.5 g冬蟲夏草粉末于玻璃試管中，加入5.0 mL(95 ℃)超純水，蓋上玻璃塞，精確稱量并置于超聲波清洗器中(65 ℃～70 ℃)超聲提取30.0 min。提取后冷卻至室溫，將混合溶液以5 000 r/min離心10.0 min，最后取上清液過0.22 μm尼龍膜(上海泰坦科技有限公司)，即得。提取液在使用前儲存在-20℃冰箱中。

1.3 ALP抑制活性測定過程

首先，將15.0 μL ALP(0.6 U/mL)添加至30.0 μL小分子化合物(10.0 mmol·L-1)或蟲草提取液中。接著加入15.0 μL p-NPP(3.2 mmol·L-1)啟動酶促反應。40 ℃孵育2.0 min后，利用紫外分光光度計于405 nm波長下測量吸光度。

1.4 分子對接研究

分子對接研究用于預測核苷酸類小分子化合物與ALP的結合位點和模式。利用Chem Office 3D繪制核苷酸類小分子化合物的化學結構。已知的ALP晶體結構(PDB ID：1EW2)來自蛋白質數據庫[13-14]。利用拉馬克遺傳算法進行對接研究。網格框中心值沿X、Y和Z軸設置為24.349、21.359和9.000，網格間距為0.375 ?，大小值設定為X=100、Y=100和Z=100。對接后，分析最低結合能的構象。利用Discovery Studio繪制對接復合體的2D圖形。

2 結果與討論

2.1 抑制活性評價

由表1可知，冬蟲夏草水提物的ALP抑制活性均在50%以上(西藏那曲樣品除外)。比較不同的加工方式，發現陰干和烘干處理的冬蟲夏草ALP抑制活性最好，凍干處理的冬蟲夏草ALP抑制活性較差。此外，同一加工方式下不同批次間，曬干處理的冬蟲夏草的ALP抑制活性批次間差異較大。比較西藏人工培植和西藏那曲冬蟲夏草ALP抑制活性發現，人工培植的冬蟲夏草酶抑制活性較好。比較不同地區的冬蟲夏草發現，ALP抑制活性也存在較大差異。以上結果表明因地理環境、氣候、加工方式等的不同導致冬蟲夏草樣品ALP抑制活性存在差異。進一步考察5個核苷酸小分子化合物的ALP抑制活性發現，AMP-2Na和CMP-2Na具有相對較好的酶抑制活性。

表1 5個核苷酸和27個蟲草提取物對堿性磷酸酶的抑制活性

2.2 分子對接研究

5個核苷酸小分子化合物在ALP上的最佳對接構象如圖1所示，ALP與5個核苷酸小分子化合物之間的結合能、氫鍵和氨基酸殘基或金屬離子相互作用見表2。AMP和ARG166、SER92、THR431、HIS153之間存在氫鍵；GMP和SER92、ARG166、GLU429之間存在氫鍵；TMP和HIS358、ARG166、SER92、HIS153、TYR169、ARG150之間存在氫鍵；UMP和PRO90、HIS358、ARG166之間存在氫鍵；CMP和SER92、ARG166、ASN167之間存在氫鍵。此外，金屬-受體相互作用存在于5個核苷酸小分子化合物和ALP之間?？傊?，分子對接結果表明氫鍵和金屬-受體相互作用是配體與ALP結合的重要作用力。此外，含有羥基、羧基或磷酸基團的化合物可能與ALP的極性基團(-NH2、-OH和Zn2+)形成氫鍵或金屬受體相互作用。

圖1 5個核苷酸小分子化合物在ALP上的最佳對接構象

表2 5個核苷酸類小分子化合物與堿性磷酸酶的對接結果

3 結論

本研究評價了27個冬蟲夏草水提物和5個核苷酸成分的ALP抑制活性。測定結果表明冬蟲夏草具有較好的ALP抑制活性，不同加工方式與不同來源樣品的ALP抑制活性存在差異。這可能因地理環境、氣候、加工方式等的不同，從而導致冬蟲夏草樣品ALP抑制活性存在差異。對5個核苷酸小分子化合物的ALP抑制活性研究發現，AMP-2Na和CMP-2Na具有相對較好的酶抑制活性。分子對接結果表明氫鍵和金屬-受體相互作用是核苷酸類小分子化合物與ALP結合的重要作用力。綜上，本研究結果可為蟲草類藥材治療疾病及加工提供參考。