PVT1及TNF基因多態性與2型糖尿病性腎病病位、病性的相關性研究

紀春敏，鄭曉軍，洪冠宇，王全興

(泉州市中醫院 內分泌科，福建 泉州 362000)

糖尿病性腎病(Diabetic kindney disease，DKD)是指由糖尿病引起的慢性腎臟病，臨床表現為持續白蛋白尿或腎小球濾過率(GFR)低于60 mL/(min·1.73 m2)超過3個月，該病是發達國家和地區終末期腎病(ESRD)的首要原因[1]。多數學者從臨床辨證論治上將DKD歸屬于中醫“消渴”“水腫”等范疇[2]。研究發現腎、肝、脾、胃為糖尿病腎病的主要病位，其主要病性表現為虛實夾雜，體現為濕、熱、痰、陰虛、氣虛、血虛、陽虛[3]。

DKD不同病位、病性對DKD病理發展演變趨勢的影響，與先天因素關系密切。研究發現在不同人群中存在一些基因與DKD易感性相關，早期識別這些基因對于早期干預DKD意義深遠。其中漿細胞瘤異位基因(PVT1)作為唯一一個與腎臟疾病相關的長鏈非編碼RNA，與DKD的發生發展密切相關[4]。PVT1可在糖尿病患者的腎小球系膜細胞中顯著表達，下調PVT1可明顯抑制腎小球系膜細胞的增殖[5-6]。另外，其還可通過上調miR-455表達，抑制高糖誘導的糖尿病腎病祖細胞損傷和凋亡[7]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種多功能促炎細胞因子，與細胞凋亡、增殖、炎癥和免疫調節等一些病理過程密切相關。橫斷面研究發現TNF-α基因rsl800629的A等位基因和AA基因型與糖尿病腎病風險顯著相關[8-9]。本研究通過“證素辨證方法”、基因型檢測技術，進一步研究DKD不同病位、病性形成與PVT1基因rs6918698及TNF基因rs1800629多態性的關系，旨在初步探討DKD不同病位、病性形成的遺傳學基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2017年1月-2018年6月于泉州市中醫院內分泌科治療的DKD患者195例。同時對照組納入本院體檢中心健康患者134例。T2DM的診斷標準參照2017年2型糖尿病防治指南[8]。DKD的診斷標準參照2019年中國糖尿病腎病疾病防治臨床指南[9]。排除標準：①年齡在30歲以下或70歲以上；②合并其他嚴重并發癥者，如高血糖高滲狀態、糖尿病酮癥酸中毒等；③合并嚴重的心、肝等并發癥；④因其他因素導致ACR升高者，如泌尿系感染、發熱、運動等；⑤出現腎功能迅速惡化，但無持續蛋白尿者；⑥導致繼發性腎損害的其他疾病，如原發性腎小球疾病、高血壓、心功能不全、血液病、自身免疫性疾病、腫瘤及藥物等；⑦精神病患者。所有研究對象彼此間無血緣關系，并且均為我市常住人群。本研究所有研究對象均簽署知情同意書，且通過我院醫學倫理委員會審核同意。

1.2 研究方法

1.2.1 中醫證素提取 以《中華人民共和國國家標準·中醫臨床診療術語》為參照，依據“600常見癥狀的辨證意義”[10]，制訂規范化四診信息采集量表，進行四診資料的規范化采集。病理要素和證素的確定參照朱文鋒《證素辨證學》[11]，以加權閾值法，結合四診信息在診斷中的權重確定。利用“中醫健康狀態辨識與咨詢系統v1.0”完成證素積分計算。根據積分判定有無證素病理改變，其中0級指證素積分之和<70，判定基本無該證素病理變化；70≤積分<100，歸為1級(輕度病理變化)；100≤積分<150，歸為2級(中度病理變化)；積分≥150，歸為3級(重度病理變化)。各癥狀對某一證素貢獻度之和達到100分通用閾值時，該證素得以診斷。

1.2.2 DNA提取 以患者空腹外周靜脈血3 mL為檢測標本，輔以中量全血基因組DNA提取試劑盒(DP2102，北京百泰克生物技術有限公司)提取基因組DNA?；蚪MDNA純度和濃度的檢測采用超微量紫外分光光度計(Nanodrop-2000，美國Thermo公司)進行，所有基因組DNA樣本的純度和濃度均滿足實驗要求。

1.2.3 PVT1及TNF基因多態性分析 本研究PVT1基因及TNF基因多態性檢測，采用上海天昊生物科技有限公司自主專利研發的imLDRTM多重SNP分型試劑盒進行。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計數資料結果以例數表示。各基因型采用直接計數法計算。各組基因型頻率的比較及各基因型證素分布采用R×C卡方檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 DKD患者PVT1基因型與病位、病性證素R×C卡方檢驗分布

病位證素脾、肝、腎、胃在PVT1基因型CC、GC、GG的分布比例接近，差異無統計學意義(P>0.05)。病性證素痰、血瘀、濕熱、陽亢、氣滯、血虛、陰虛、陽虛在PVT1基因型CC、GC、GG的分布比例接近，差異無統計學意義(P>0.05)。但氣虛在風險基因型GC上分布比例顯著升高(P<0.01)。見表1、表2。

表1 DKD患者PVT1基因型與病位證素相關性分析

表2 DKD患者PVT1基因型與病性證素相關性分析

2.2 DKD患者TNF基因型與病位、病性證素R×C卡方檢驗分布

病位證素肝、脾、腎、胃在TNF基因型AA、GA、GG的分布比例接近，差異無統計學意義(P>0.05)。病性證素血瘀、濕、熱、陽亢、氣滯、氣虛、血虛、陰虛、陽虛在TNF基因型AA、GA、GG的分布比例接近，差異無統計學意義(P>0.05)。但痰在風險基因GG上分布比例顯著升高(P<0.05)。見表3、表4。

表3 DKD患者TNF基因型與病位證素相關性分析

表4 DKD患者TNF基因型與病位證素相關性分析

3 討論

糖尿病腎病可導致尿毒癥，嚴重危害人類健康，給公共醫療帶來了巨大壓力。臨床發現DKD的發生并不局限于血糖或血壓控制不達標的患者。研究表明，DKD具有強烈的遺傳易感性，我們提出假設：DKD的疾病過程是否具有其特征的遺傳易感性。一項家族聚集研究發現，在同樣都有高發糖尿病的家庭中，一些家庭罹患DKD的風險大大提高，而另一些家庭卻沒有[11]?？梢娺z傳因素在DKD的疾病進程中占據不容忽視的地位。近年來，通過全基因組關聯分析(Genome wide associa-tion study，GWAS)發現了許多與DKD關聯密切的基因和多態性位點。本課題研究前期成果發現PVT1基因rs6918698、TNF基因rs1800629與DKD的遺傳易感性顯著相關(另文發表)。但這兩個基因與DKD的病位、病性形成、變化轉歸關系如何，尚缺乏系列報道。

本課題發現在病性證素上，與無氣虛比較，氣虛的分布比例在PVT1風險基因型GC上顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。這提示PVT1風險基因GC可能是DKD患者多發氣虛的遺傳學基礎之一?！端貑枴そ浢}別論》言：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調水道，下輸膀胱，水精四布，五經并行?！比幌驶颊?，雖多飲多食，但食入之品未能利用，反見神疲、虛胖、無力等正氣虛象。正氣虧虛，津液生化伐源，水谷精微運化失常，不能為臟腑提供能量。王向明等[12]研究認為腎臟能量供應是否充足影響著糖尿病腎病的病情進展，其將腎氣虛比象于糖尿病腎病腎臟能量供應障礙，提出具有抗氧化應激、減輕線粒體損傷以及增進ATP合成的補氣類中藥可一定程度上使腎臟損傷得以改善?！妒備洝吩疲骸跋嗜站?，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，小便至甜，有膏”，從先天因素分析了消渴病腎病與腎氣虛密切相關。腎主水、藏精，腎氣虛，則氣化失司，蒸騰乏源，水液失布，精關不固，發為水腫、蛋白尿。無論是先天不足，還是后天虧虛，氣虛貫穿消渴病腎病的整個發病過程。臨床辨證論治上，王震宇等[13]從552例糖尿病腎病患者中分析發現氣虛為糖尿病腎?、颉羝诤诵淖C型。遠方教授認為虛是導致糖尿病腎小球動脈硬化的始動因素，在治療消渴病腎病上，主張利用升清降濁法，以補中益氣湯加味，重用黃芪及葛根為君藥已達補中氣、升清陽之效，臨床收效顯著[14-15]?！渡褶r本草經》記載黃芪為補氣圣藥，古籍文獻研究發現，補氣藥黃芪在糖尿病腎病中應用最多[16]?，F代藥理研究發現，黃芪中富含的黃芪多糖可使糖尿病腎病腎臟病理改變減輕，抑制腎間質纖維化，使腎功能改善。黃芪通過調節MMP-2/TIMP-2動態平衡，從而減少腎小球細胞外基質(ECM)的沉積，延緩腎纖維化進程[17]。

與非痰證相比，痰證在TNF風險基因GG的分布比例上顯著升高(P<0.05)，提示攜帶GG風險基因的人群更容易兼夾痰證。消渴病機以本虛標實為主，臨床生理演變過程中痰邪貫穿其中?！端貑枴て娌≌撈穼⑾什C治法概括為“此肥美之所發也，此人必數食甘美而多肥也，肥者令人內熱，甘者令人中滿，故其氣上溢轉為消渴，治之以蘭，除陳氣也”。陳氣實則脾胃運化失常所致的病理產物“痰邪”。痰作為病理產物，又是致病因素，其可使機體臟腑功能失調，是糖尿病重要的發病基礎，如此惡性循環，變證叢生，成為糖尿病合并DKD的主要原因。痰飲致病，隨氣流竄至全身，無處不到，產生各種不同病變?！峨s病源流犀燭·痰飲源流》說：“其為物則流動不測，故其為害，上至巔頂，下至涌泉，隨氣升降，周身內外皆到，五臟六腑俱有?！迸c丹溪所述“善治痰者，必先治氣”不謀而合。王麗華等[18]擬祛痰通絡方治療糖尿病腎病大鼠，發現治療后糖尿病腎病大鼠腎臟中內質網應激反應明顯增強，可見，其腎臟保護作用的核心機制可能在于祛痰通絡湯可有效降低內質網應激。

綜上所述，特定體質的人群在某些證上的易患性升高，恰恰說明證存在一定的基因遺傳學基礎。陳可冀[19]認為以病證結合為法，中醫藥治療DKD總體療效優于單純西藥治療。本研究發現DKD患者中氣虛質及合并痰證人群具有典型的基因遺傳多態性特點，一定程度闡釋了不同證的形成與先天因素的相關性，也為臨床遣方用藥治療DKD提供了基因遺傳學依據。